چشم اندازی از گذشته تا امروز

در روش مستقیم برای جستجو و کشف آنتی ژن در سطوح بافتی فیکس شده، از آنتی بادی کنژوگه شده با FITC استفاده می شود و کمپلکس، زیر میکروسکوب فلورسنس بررسی می شود.

در روش IIFA آنتی ژن می تواند سلول، گسترده باکتریایی، پروتئین، آنتی ژن های خالص شده و ..... باشد.

 در این روش هدف، شناسایی و تعیین تیتر آنتی بادی های مجهول در مایعات بیولوژیک مانند سرم، CSF، .... است.

چنانچه در مایعات بیولوژیک آنتی بادی بر علیه آنتی ژن فیکس شده روی اسلاید تشخیصی (Slide, microplate, membrane و ....) وجود داشته باشد. کمپلکس اولیه Ag –Ab تشکیل می شود.

پس از مراحل انکوباسیون و شستشو، آنتی گلوبولین (AHG) که با رنگ فلورسنس کنژوگه شده به کمپلکس اضافه می شود که در نهایت کمپلکس ایجاد شده روی اسلاید تشخیصی زیر میکروسکوپ ایمونوفلورسنس برررسی و ارزیابی می شود.

 

در روش های معمول، آماده سازی سوبسترا (آنتی ژن فیکس شده روی اسلاید)  معمولاً به شکل زیر انجام می شود:

تهیه بافت مشخص که حاوی آنتی ژن های هدف (Target Ag) باشد. این بافت ها معمولاً از پستانداران مانند Rat واز بافت های معده، کبد، کلیه، روده، ریه، مغز و ... آماده می شود.

بافت ها پس از مراحل برش انجمادی (frozen section) روی اسلایدها تثبیت می شود.

این روش اولیه و معمول، Single Tissue section نامیده میشود.

 

 

در روش های جدیدتر سلول های ویژه ای مانند HEp-2، مشتق از رده سلولی کارسینوم لارنژیال انسانی ، مورداستفاده قرار میگیرد.

ویژگی سلول های HEp-2 این است که دارای آنتی ژن های اختصاصی می باشد که حدود 30 نوع الگوی متفاوت هسته ای و سیتوپلاستیک و حدود 50 نوع اتوآنتی بادی مختلف مربوط به تعداد زیادی از بیماری های اتوایمون را می توان با آن ها تشخیص داد.

اخیراً تکنولوژی BIOCHIP برای تهیه اسلایدهای میکروسکوپیک طراحی شده است که روی یک اسلاید تعداد 10 عدد و بالاتر  BIOCHIP دارای سلول HEp-20-10 و یا ترکیبی از برش بافت Primate  و سلول تثبیت می شود. در موارد ترکیبی می توان  آنتی ژن هدف را همزمان هم در سطح برش بافتی و هم سلول تثبیت شده بررسی نمود.

 

نکته: سلول های HEp-20-10 نسبت به سلول HEp-2 دارای 10 تا 20 برابر سلول های میتوتیک (در فازمیتوز) بیشتر می باشند که این امر تشخیص آنتی بادی ضد ساختارهای اختصاصی موجود در سلول های میتوتیک مانند Centromeres, Spindte fibres, Separation zone, Centriols NOR  و ....) را نسبت به سلول های HEp-2 بسیار ساده تر می کند.

 

نکته: در تکنولوژی BIOCHIP ، امکان تثبیت سوبستراهای مختلف و متنوع روی یک اسلاید بررسی، و در یک میدان میکروسکوپی با یک نمونه سرم با عنوان Multiplex test میسر می شود.

 

نکته: تکنیک ترکیب سوبستراهای مختلف مانند استفاده همزمان از سلول های HEp-2/ HEp10-20 و سلول های کبد primate روی یک اسلاید، و یا نقاط اختصاصی (EUROPLUS-Monospecific)، امکان بررسی و تایید نتایج و تحلیل پاسخ های مختلف را فراهم می سازد.

 

نکته: تکنولوژی پیشرفته EUROPLUS نوعی Multiplex Test   است که روی یک اسلاید تشخیص ترکیبی از

1- Tissue sections

2- Culture cells

3-Transfected cells

4- Defined single antigen

تثبیت شده است که انتی ژن های موجود در هر مجموعه با روش ایمونوفلورسنس بررسی می شود.

مثال: سلولهای ترانسفکت شده با Recombinant cell IFT RC-IFT

نکته: این روش تکنولوژی جدیدی جهت ردیابی و جستجوی آنتی ژن ها در سطح سلول های خاص می باشد.

در این روش DNA کد کننده آنتی ژنی خاص وارد پلاسمید یک باکتری می شود و این پلاسمید وارد یک رده سلولی خاص می گردد. تکثیر سلولی منجر به عرضه آنتی ژن خاص در سطح سلول ها تکثیر شده می گردد؛ حال آنتی ژن های سطحی با روش ایمونوفلورسنس ردیابی می شوند.

در روش RC-IFT از رده سلول های کلیه جنینی یا Human  Embryonic kidney (HEK-293)استفاده می شود؛ سلول HEK به خوبی در محیط های کشت سلول رشد و تکثیر می یابند و سلول های بسیار مناسبی برای Transfection و عرضه آنتی ژن های مختلف می باشند.