آزمایش ANA

آزمایش ANA اولین قدم منطقی در افتراق بیماران مبتلا به بیماری های خودایمن سیستمی از سایر بیماری ها می باشد. تشخیص بیماریهای روماتوئیدی خودایمن سیستمی به دلیل طیف وسیع سندرم ها و هم پوشانی آن ها با یکدیگر بسیار چالش بر انگیز می باشند. علاوه براین، در حالیکه شیوع ANA در این بیماران بسیار بالاست، این آنتی بادی ها همچنین در بیماران مبتلا به بیماریهای خودایمن وابسته به عضو (بطور مثال بیماریهای خودایمن کبد و تیروئیدیت هاشیموتو)، بعضی عفونتها، سرطان، و سنین بالا و حتی در بعضی افراد سالم نیز یافت می شوند.  

استفاده از تعیین ANA بعنوان تست تشخیصی در بیماری های روماتوئید خودایمن سیستمیک به مشاهدات اولیه در سلولهای لوپوس اریتماتوز توسط هارگراوز و همکارانش در سال 1948 بر می گردد. تا آن زمان، تشخیص SLE اغلب بدون وجود نمونه بافت بیمار امکان پذیر نبود. مطالعات اولیه برای تعیین ANA با روش ایمونوفلورسنت غیرمستقیم (IFA) بر روی برش های تهیه شده از بافت کلیه و کبد موش بعنوان ماده اولیه انجام می گرفت. استفاده از سلولهای HEp-2، با منشا اپیتلیوم حنجره انسانی، حساسیت بیشتری برای تعیین ANA فراهم آورد که احتمالا بخاطر قابلیت سریع تقسیم آنها در in vitro و وجود هسته درشت و به این ترتیب تسهیل تشخیص الگوهای مربوط به  آنتی بادی های خودایمن می شد بود.اگرچه تعیین  ANA به روش IFA چالش برانگیز و پرزحمت محسوب میشد، افزایش کاربرد آنتی بادی های خودایمن در تشخیص و طبقه بندی بیماریهای SARDs  و تلاش برای هماهنگی نامگذاری ها در آزمایش و گزارش نتایج، این روش را همچنان یک ابزار قوی در غربالگری پابرجا نگه داشت و آزمایش ANA در تعدادی از دستورالعمل های تشخیصی گنجانده شده است. بعنوان مثال ،یافته های ANA مثبت بعنوان شاخص تشخیص SLE توسط دانشکده آمریکایی روماتولوژی (ACR) در اوایل دهه 1980، با بازنگری بعدی در سال 1997 ،درنظر گرفته شد. در سال 2013، یک کمیته الحاقی با مشارکت ACR و تیم اروپایی علیه روماتیسم (EULAR) مشخصات جدید  طبقه بندی SSc را ارائه دادند که آنتی بادی های خودایمن ANA را نیز در برداشت و آنها را به این صورت نامگذاری کردند: آنتی توپوایزومراز 1 (anti-topo I) یا (anti-Scl-70)، آنتی سنترومر(ACA)، و آنتی RNA پلی مراز 3 (anti-RNAP III).

 

کاربرد آزمایش ANA

آزمایش ANA معمولا برای تشخیص SARD، و با استفاده از تعیین هویت آنتی بادی های متصل به اهداف داخل سلولی، بکار می رود. حضور ANAs عموما بیانگر پاسخهای غیر نرمال به آنتی ژنهای خودی می باشد، که خصیصه اصلی بیماری های خودایمن است. در ارزیابی های آزمایشگاهی بالینی، ANAs عموما بر اساس تشخیص الگوهای هوموژنوس، گرانولار، سنترومر، و هستکی دسته بندی می شوند. در حالیکه آزمایش ANAs بعنوان قسمتی از روش های تشخیص برای بعضی بیماریهای SARDs (بطورمثال SLE،MCTD، و SjS) بکار می روند، حضورشان ممکن است بعنوان ملاک تشخیصی مهمی برای سایر بیماریها (بطور مثال IIMs،SjS ثانویه، و آرتریت جوانان) در نظر گرفته شود.

تشخیص الگوهای ANA با استفاده از سلولهای HEp-2 بعنوان ماده زمینه ممکن است در تعیین حضور آنتی بادی های خودایمن  و همچنین پیش بینی نوع بیماری کمک کننده باشد. در همین راستا، یک الگوی غربالگری مثبت ANA می تواند راهنمای خوبی جهت انجام آزمایش تکمیلی، تشخیص بالینی  و یا پیش آگهی یک بیماری  باشد. جدول 1 بعضی از الگوهای متداول ANA ، خصوصیات آنتی بادیهای همراه این الگوها و ارتباطات بالینی با بیماری ها را نشان می دهد. آنتی بادی های علیه DNA دورشته ای (dsDNA) و اسمیت (Sm) اغلب همراه با SLE دیده می شوند، در حالی که آنتی بادی های علیه SSA-52 و Ro-60 نشانه های مهمی برای SjS محسوب میشوند، اگرچه در سایر بیماریهای SARDs نیزدر مقادیر متفاوت دیده میشوند. آنتی بادیهای علیه ریبونوکلئوپروتئینها (RNPs) یا کمپلکسهای هسته کوچک RNP (snRNP) ممکن است در بیماران دچار SLE یا MCTD دیده شود. بیماران دچار MCTD شکل متفاوتی از بیماریهای روماتوئیدی هستند که وجود آنتی بادی ضد U1-RNP برای تشخیص شان مهم می باشد. آزمایشهای ANA همچنین در تمامی موارد SSc با الگوهای خاص همراه با چندین آنتی ژن هدف مثبت می باشند. برای مثال، انواع ANAs در SSc (آنتی RNAP III، آنتی Th/To، آنتی پلی میوزیت (PM)/اسکلرودرما (Scl)، آنتی Ku، و آنتی (U3-RNP) پروتئین هایی را مورد هدف قرار می دهند که در هسته و هستک یافت می شوند. این آنتی بادی ها همراه با تظاهرات خاصی از SSc ،شامل درگیری عضو، و پیش آگهی مناسب می باشند. از میان تعداد زیادی از آنتی بادی های SSc، تنها سه آنتی بادی اصلی (آنتی بادیهای ACA، آنتی توپو I، و آنتی RNAP III) در معیارهای طبقه بندی توصیه می شوند، به علاوه آنتی بادی علیه Th/To و U3-RNP همچنین برای SSc اختصاصی در نظر گرفته می شوند در حالیکه آنتی بادی های علیه PM/Scl،U1-RNP و Ku معمولا در بیماران دچار سندرم های هم پوشانی مانند PM و SSc و یا SLE و SSc نیز دیده می شوند.در سالهای اخیر آزمایش ANA ارزیابی IIMs مفید شناخته شده است در حالی که الگوها و خصوصیات ANAs در IIMs بسیار گوناگون است. تعیین آنتی بادی های خودایمن در تشخیص و تمایز بین زیرگروه های میوزیت و برای پیش بینی و تحت نظر گرفتن پیشرفت تظاهرات بالینی، درگیری عضو، و خطر سرطان ها مفید می باشد.عموما، این آنتی بادی های بعنوان آنتی بادی های اختصاصی میوزیت (MSAs) یا آنتی بادی های همراه میوزیت (MAAs) دسته بندی میشوند.آنتی بادی های MSAs معمولا انحصاری بوده و ابزار تشخیص IMMs هستند.

 

جدول 1

الگوهای معمول آنتی بادی های ضد هسته ای، آنتی ژن های مربوطه و بیماری های همراه

 

 

مسائل امروزی نامگذاری آنتی بادی های ضد هسته ای

تشخیص آنتی بادی به وسیله روش IFA اتصال به آنتی ژن های داخل سلولی و در نتیجه تولید الگوهای مختلف رنگ آمیزی را نشان می دهد که معمولا بر اساس زیر مجموعه های تشخیصی دسته بندی می شوند; به علاوه شدت اتصال بوسیله تیتر یا شدت رنگ فلورسنت ایجاد شده تعیین می گردد. تعیین تیتر و الگوی ANA ،بخصوص در مقایسه با سایر روشهای تعیین ANA ،از نظر بالینی با ارزش محسوب می شود. همانطور که در بالا اشاره شد، الگوهایی که اغلب توسط آزمایشگاه های بالینی تشخیص و گزارش می گردد الگوهایی هستند که ناحیه هسته ای را رنگ آمیزی می نمایند و به عنوان الگوی هوموژنوس، گرانولار، سنترومر و هستکی از آنها یاد می شود. استفاده از سلولهای HEp-2 بعنوان ماده زمینه،امکان ایجاد الگوهای هسته ای دیگر و همچنین واکنش سایر اجزای سلول خارج از هسته (الگوهای سیتوپلاسمی) و خصوصیات همراه با مراحل مختلف تقسیم میتوزی (الگوهای میتوتیک) در تشخیص بیماریهای SARDs را امکن پذیر ساخته است. اما، حضور یا عدم حضور این سلول ها و یا مقادیر بعضی آنتی ژنهای موجود در این سلول ها، میتواند در بین محصولات تولید شده توسط کارخانه های مختلف متفاوت باشد. علاوه براین، ممکن است افراد با تجربه که برای تشخیص و تمایز الگوهای مختلف و گزارش تیتر آنها لازم می باشند، در اغلب آزمایگاههای بالینی در دسترس نباشند.

اخیرا، توصیه هایی برای ارزیابی ANAs و نامگذاری استانداردی توسط نشست بین المللی الگوهای ANA (ICAP)منتشر شده است. متخصصان ICAP توصیه می کنند که الگوها به سه گروه اصلی با نامهای الگوهای هسته ای، سیتوپلاسمی ومیتوتیکی دسته بندی شوند (www.ANApatterns.org). نشست ICAP همچنین 28 الگوی مشخص بر روی سلول های HEp-2 را ارائه داده و برای هر الگو یک کد (AC) از 1 تا 28 را ارائه دادند و سطوح تشخیصی پایه تا مجرب را نیز جهت تشخیص این الگوها  تعیین نمودند. از این 28 الگو، الگوهای هوموجنوس، گرانولار، سنترومر، نقاط هسته ای مجزا، هستکی، وهسته دنس فاین اسپیکل(AC-1 تا AC-14) بعنوان الگوهای اصلی ANA و سطح پایه در نظر گرفته شده است. برای الگوهای سیتوپلاسمی (AC-15 تا AC-23)،دسته بندی ICAP الگوهای رشته ای، گرانولار، آنتی بادی رتیکولار/آنتی میتوکندری (AMA)، و قطبی/شبه-گلژی و همچنین میله و حلقه را متعلق به سطح کارشناسی پایه در نظر گرفته است. تمامی الگوهای متعلق به دسته میتوتیک بعنوان سطح تشخیصی مجرب در نظر گرفته شده است. از بین الگوهای متعلق به سطح کارشناسی مجرب، نقاط هسته ای مجزا کمتر قابل تشخیص بوده و مطالعات روی الگوی دنس فاین اسپیکل نشان می دهد در حال حاضر صلاحیت فنی برای تشخیص آن وجود ندارد. با این حال، اهداف اصلی ICAP ایجاد هماهنگی درنام گذاری آنتی بادی های خودایمن، تفسیر و بهینه سازی استفاده از یافته های ANA در مراقبت بهتر از بیمار می باشد. از سایر اهداف اصلی نامگذاری ICAP ، توصیفی از هر یک از الگوهای اصلی ANA و همراهی آن ها با بیماری خاص است. علیرغم قبول نقش الگوهای غیر هسته ای (سیتوپلاسمی و میتوتیک) از نظر کلینیکی ، هیچ اتفاق نظری در مورد گزارش آنها بعنوان ANA مثبت یا منفی وجود ندارد.

 

ارزیابی آنتی بادی های ضد هسته ای

از زمانیکه ارزیابی ANA بعنوان یک آزمایش رایج بالینی انجام می پذیرد، روشهایی مختلفی برای تعیین ویا اندازه گیریANA بوجود آمده است. روش IFA با استفاده از سلولهای HEp-2 بعنوان روش استاندارد برای تعیین ANAs همراه با تعدادی مزایا و معایب در نظر گرفته شده است. چالشهای اصلی مربوط به ANA عبارتند از: سختی کار ( میزان قابل توجهی آموزش که برای کارشناس مورد نیاز است)، دخالت فرد در تعیین تیتر و تشخیص الگو، غیراستاندارد بودن مواد مصرفی، و کمبود نیروی کار در آزمایشگاه ها.

بنابراین، در بعضی آزمایشگاهها، روشIFA برای تعیین ANA با روشهای پر بازده و با دخالت فردی کمتر همچون الایزا ، LIAs و MBAs جایگزین گردیده است. روشهای غیر IFA در منبع تهیه آنتی ژن، خلوص و غلظت آنتی ژن،  ظرفیت اتصال آنتی ژن، مواد و استانداردهای بکار گرفته شده درتست، آنتی بادی های ثانویه (کونژوگه) و تشخیص سیگنال  متفاوت هستند. بنابراین، تفاوت در صحت تشخیصی بین آزمایشهای مختلف حتی در صورت تبعیت از اصول یکسان، در بیماران در یک دوره ممکن است دیده شود. نگرانی  در مورد کاهش حساسیت آزمایش های جدید پربازده و اطلاع پزشکان از روشهای متفاوت تشخیص ANA و محدودیت های همراه شان منجر به این شد که هم کالج آمریکائی روماتولوژی و هم گروههای مجرب بین المللی توصیه ای برای نامگذاری، ارزیابی و تفسیر ANA ارائه دهند. برخلاف محدودیت های تشخیصی ANA توسط روش IFA با استفاده از سلولهای HEp-2 بعنوان ماده زمینه، این روش بخاطر حساسیت بالا بدلیل دربرگیری بالاترین تعداد آنتی ژن در سلول های HEp-2 همچنان روش استاندارد برای ارزیابی ANA باقی مانده است.

 

روش آنتی بادی غیر مستقیم فلورسنت

روش IFA براساس اصول ساده ایمونولوژیکی با انکوباسیون سرم بیمار با ماده زمینه (سلول ها یا تکه های بافت) که به لام فیکس شده است میباشد. در حال حاضر، سلولهای HEp-2 به دلیل دارا بودن هسته بزرگ و طیف وسیعی از آنتی ژنهای همراه با SARDs، بعنوان ماده زمینه ارجح برای ارزیابی و اندازه گیری میزان ANA در نظر گرفته میشود. تعیین تیتر نهایی با تهیه رقت سریالی از نمونه های مثبت مورد آزمایش بدست آید. رقت های مورد استفاده در غربالگری مابین آزمایشگاههای مختلف متفاوت میباشد که این مورد در زمان تفسیر جواب باید در نظر گرفته شود. در رقت سرم 1:40، تعداد زیادی از افراد سالم ممکن است از نظر ANA مثبت باشند، با این حال میزان مثبت شدن با افزایش رقت سرم کاهش می یابد که البته همراه با کاهش حساسیت آزمایش نیز خواهد بود. حذف نامگذاری غیر استاندارد، غلظت آنتی ژن، شرایط فیکس سلول، نوع و کیفیت میکروسکوپ، اختصاصیت آنتی بادی ثانویه و تعیین کات آف عواملی هستند که در تناقضات انجام آزمایش ANA به روش IFA سهم دارند. میزان برخی آنتی ژن ها در سلولهایHEp-2 همچون SSA-A/Ro ،ممکن است حساسیت تست در تعیین آنتی بادی های علیه این ملکول را در افراد بیمار محدود کند. گزارش شده است که سلولهای HEp-2  دستکاری و ترانسفکت شده با 60-kDa Ro/SSA انسانی مزیت بیشتری در مقایسه با سلولهای HEp-2 عادی در تعیین آنتی بادی های آنتی Ro در سرمهای ANA منفی داشته اند. سایر ویژگی های کیت ANA همچون نحوه فیکس سلولها و ویژگی آنتی بادی ثانویه، کماکان غیر استاندارد باقی مانده اند. کات آف مناسب برای مثبت بودن همچنان یکی از مسائل حل نشده در آزمایش ANA باقی مانده است. با استفاده از رقت غرباگری 1:80 ، شیوع ANA در جمعیت بالای 12 سال آمریکا 13.8% ( فاصله اطمینان [CI] 95%، 12.2% تا15.5%) گزارش گردید. شیوع ANA گزارش شده در مطالعات آمریکا با آنچه در گزارشات منتشر شده اخیر در آلمان دیده شد مشابهت داشت. همینطور در گزارش دیگری، زنان شیوع بیشتری از نظر مثبت بودن ANA نسبت به مردان داشتند که میتواند مربوط به عوامل هورمونی و تولید مثلی باشد. به علاوه افزایش مثبت بودن ANA با افزایش سن و ارتباط آن با جنسیت گزارش شده است،  در حالی که عوامل دیگری نیز در این افزایش دخیل هستند. مشکل دیگری در رابطه با مثبت بودن نتایج ANA در افراد سالم است که ممکن است به علت شروع بیماری پری کلینیکال باشد. برخلاف آزمایشات سرولوژیک در بیماریهای عفونی، که نتایج آنتی بادی ممکن است فعال یا غیر فعال بودن بیماری را مشخص نماید و نتایج مثبت کاذب به آسانی مشخص میشود، به این نتیجه رسیده اند که آنتی بادی های خودایمن ممکن است پیش از شروع بیماری و قبل از ظهور علائم بالینی مثبت شوند. در این حالت، مثبت بودن  ANA مستعد بودن فرد برای بیماری خودایمن را پیشنهاد میدهد. از طرف دیگر،نتایج مثبت کاذب در افراد ظاهرا سالم یا بیمارانی که دچار SARDs نیستند ممکن است مربوط به اتصال اختصاصی و یا واکنش متقاطع با آنتی ژن های اختصاصی نظیر DFS70 یا غیر اختصاصی باشد. الگوی DFS70 همراه با اتصال آنتی بادی های خودایمن به پروتئینهای موجود در همه جا که LEDGF  (یا محصول ژنی p75 یا psip 1 )نامیده میشوند می باشد که اولین بار توسط Ochs و همکارانش در سال 1994 توصیف شد و متعاقبا در بیماران دچار درماتیت آتوپیک و آسم گزارش گردید.اگرچه آنتی بادی های علیه DFS70 مرتبط با  شرایط بالینی مختلفی بوده است، ولیکن این آنتی بادی ها عموما در افراد سالم نیز وجود دارند. مهمترازآن، سطوح پایین این آنتی بادی ها ممکن است در بیماران دچار بیماری های خودایمن همراه با تولید ANA دیده شود. بنابراین، حضور آنتی بادی های علیه DFS70 ممکن است احتمال حضور یک بیماری خودایمن را حذف نماید، اگرچه در صورت همراهی با تستهای مثبت ارزیابی  بیمار را تحت تاثیر قرار میدهد. با استفاده از سلولهای HEp-2، الگوی DFS70 بوسیله رنگ آمیزی با الگوی دنس هتروژنوس فاین اسپیکل نوکلئوپلاسم در مرحله اینترفاز و رنگ آمیزی اسپیکل همراه با کروماتین در طی میتوز مشخص شده است. اما، این الگو براحتی حتی توسط افرادیکه بخوبی آموزش دیده اند نیز قابل تشخیص نیست و ممکن است بعنوان الگوی گرانولار گزارش شود. در دسترس بودن روشهای ایمنواسی  که آنتی ژن DFS70 را مورد هدف قرار میدهند بنظر میرسد به  کم کردن خطای فردی در تفسیر این الگو در آزمایش IFA کمک نماید.

 

ایمنواسی جایگزین تعیین آنتی بادی های ضد هسته ای

افزایش درخواست آزمایش ANA در آزمایشگاه های بالینی منجر به وجود نیاز به روشهای پربازده، آسان تر، و علمی تر برای تعیین و اندازه گیری ANAs شده است. انواع گوناگونی از ایمنواسی های پیچیده یا آسان دستی یا اتوماتیک (بیشترین روش های بکار رفته شامل ELISA، ایمنو اسی  کمی لومینسانس [CLIAs]، LIAs، و   MBAsمی باشند)، با مشخصه های اجرایی متفاوت، ابداع شده اند. مزیت این رویکردهای جایگزین نسبت به آزمایشANA  به روش IFA  شامل سهولت استفاده، امکان انجام آنالیز پربازده کمی، عدم دخالت فرد، و یکپارچگی تمام آزمایش های مربوط به ANA می باشد. مهم ترین عیب استفاده از روش های غیر IFA برای تعیین ANAs مربوط به نتایج منفی کاذب، به علت محدودیت تعداد آنتی ژن ها، و تشخیص نهایی در زمانی است که نتایج آزمایش غربالگری مثبت شده ولی نتایج آزمایش اختصاصی متعاقب IFAبرای ANA  منفی است.

از بین تمام روش های غیرIFA ، روش الایزا یکی از شایع ترین و پرکاربردترین روش های موجود در آزمایشگاه های بالینی می باشد. کیت های الایزا موجود ANA اشکال گوناگونی از آنتی ژن ها (سوبسترا) و آنتی بادی های ثانویه را دارا می باشند. درحالی که اغلب کیت های الایزا برای تعیین ANA عصاره سلول های HEp-2 آمیخته با ترکیبی از پروتئین های خالص، نوترکیب یا ذاتی همراه با SARDs شایع را بکار می برند، تعداد اندکی از این کیت ها نیز از سلول های HEp-2 استفاده نمی کنند. بنابراین، بسته به ترکیبات الایزا، ارزیابی نتایج آزمایش های بالینی براساس آنتی ژن های خاص بکار رفته متفاوت هستند. برای کیت هایی که با مخلوطی از عصاره سلول های HEp-2 با غلظت های معین کار می کنند، آنتی ژن ها می توانند برای اتصال به سطح موجود با هم رقابت کرده، و روی وجود هدف های آنتی ژنیک اثرگذار باشند. از سوی دیگر، تغییرات ساختاری در سطح آنتی ژن ممکن است باعث نتایج نامطلوب گردد. بطور عمومی، کیت های الایزا که بر اساس استفاده از هدف های آنتی ژنیکی معین میباشند حساسیت کمتر و ویژگی عالی برای بیماری های بافت پیوندی دارند و ممکن است برای ارزیابی بیماری های خودایمن کبد یا برخی بیماری های  SARDs نظیرIMMs و SSC، مفید نباشند. اصول آنالیتیکال برای CLIAs از الایزا متفاوت می باشند، اما تصویر کلی استفاده از CLIA برای تعیین ANA شبیه الایزا است. برخلاف الایزا، آنزیم های بکار رفته در CLIAs ، بجای ایجاد رنگ ، یک سوبسترا را تبدیل به نوعی محصول می نماید که  باعث ساطع شدن یک فوتون نور می گردد .CLIAs دامنه اندازه گیری وسیع تری داشته و نسبت به الایزا حساس تر و برای اتوماسیون راحت تر است و بنابراین در آنالیزهایی با بازده زیاد روش ارجح محسوب میشود.

آزمایشات چندگانه نیز از لحاظ اساس کار شبیه الایزا و CLIA هستند اما با این تفاوت که قابلیت تعیین چندین آنتی بادی مستقل مربوط به ANAs را دارند. در LIAs یا MBAs ،مجموعه ای از آنتی ژن ها ،که معمولا شامل پروتئین های خالص شده، پروتئین های بکر (Native)، پروتئین های نوترکیب یا پپتیدهای سنتز شده هستند، در خطوط موازی به غشای نایلونی یا بیدها متصل شده تا یک ماده زمینه (سوبسترا) برای تشخیص آنتی بادی فراهم آورند. بعد از اینکه سوبسترا در معرض نمونه رقیق شده بیمار قرار می گیرد، وجود آنتی بادی های خودایمن توسط یک محلول آنتی IgG انسانی که یک آنزیم یا فلوروفور به آن متصل است تعیین می گردد. این روش قابلیت اتوماسیون داشته و این امتیاز را دارد که همزمان چندین انتی بادی خودایمن را تعیین می نماید. روش MBAs از لحاظ تکنیکی پیچیده تر از روش LIAs می باشد، و قابلیت تعیین تعداد بیشتری آنتی بادی خودایمن را دارا می باشد. درMBAs از تعدادی بید، با شدت های متفاوت ایمونوفلوزسانس که هر کدام با آنتی ژن متفاوتی پوشیده شده اند، استفاده می شود. آنتی بادی های خودایمن علیه آنتی ژن های متفاوت  می توانند بطور کمی یا کیفی تعیین شوند که این کار بوسیله تعیین واکنش دهی آنها به بید های مختلف با استفاده ازخوانش فلورسانس یا کمی لومینسانس ایجاد شده امکان پذیر می باشد. در روش LIAs ، اساس تعیین آنتی بادی شبیه الایزا می باشد، به طوری که آنتی بادی ثانویه به یک آنزیم متصل است و وجود آنتی بادی های خودایمن توسط آنالیز دنسیتومتریک بصورت کمی یا کیفی صورت میگیرد.

در مقایسه با روش IFA، روش های جایگزین برای تعیین ANAs حساسیت کمتر و ارزش پیش بینی ضعیف تری دارند حتی اگر از سلول های HEp-2  نیز استفاده نمایند. این موضوع به خصوص در رابطه با بیماری های SARDs ازجمله SSc و IIMs اهمیت بیشتری دارد. برای مثال، گزارش شده است که بیماران مبتلا به میوزیت برای طیف وسیعی از آنتی بادی های ضد آنتی ژن های مختلف (نظیر tRNA سنتتاز ، SRP، یا Mi-2 ) همراه با الگوهای خاص ایمونوفلورسنت ANA مثبت بوده اند ، که در حال حاضر تشخیص قطعی نیازمند اشکال اختصاصی از تست هایی نظیر  ایمونوپرسی پیتاسیون پروتئین یا ایمونوپرسی پیتاسیون RNA می باشد که در آزمایشگاه های تشخیص طبی در دسترس نیستند.

اگرچه تعدادی از این تست ها با استفاده از روش های جایگزین ایمونو اسی ANA در دسترس می باشند، صحت تشخیصی آن ها معمولا به خاطر پیچیدگی آنتی ژن های هدف محدود می باشد. مهم ترین امتیاز استفاده از روش های جایگزین شامل موارد زیر میباشد: ویژگی بیشتر، زمان سریع تر، عدم دخالت فرد، بازده بیشتر و مقادیر مرجع مشخص برای آنتی بادی های خودایمن در بیماری های شایع SARDs همچون SLE،  SjS  ، و MCTD، مفید باشند. در مقایسه با الایزا، تست های چندگانه قابلیت این را دارند که ابزار مفیدی برای آنالیز چندین آنتی ژن به صورت هم زمان یا ارزیابی بیماری هایی با خصوصیات چندین  بیماری خودایمن ،همانند SSc، SLE و IIM  باشند.

 

اتوماسیون تست ایمونوفلورسانس آنتی بادی ضد هسته ای

برخلاف چالش های شناخته شده مرتبط  با آزمایش ANA به روش IFA ، اصلی ترین نقطه قوت این روش مطرح شدن آن بعنوان یک  ابزار غربالگری برپایه تنوع الگوهای رنگ آمیزی شده وآگاهی از ارتباط این الگوها با آنتی بادی های خاص و بیماری های بالینی است. تلاش های قابل توجهی برای کاهش سختی کار و عدم دخالت فرد در تفسیر الگوهای ANA از طریق پیشرفت و تایید دستگاه هایی برای حمل و شستشوی اسلایدها و نرم افزارهایی برای تشخیص تصاویر انجام گرفته است. اتوماسیون هر دو قسمت تست ANA (مراحل انجام تست و بررسی دیجیتالی الگوها) بطور قابل توجهی چالشهای آزمایش ANA به روش IFA را به حداقل رسانده است.

تعدادی از سیستم های اتوماتیک بررسی نتایج آزمایش ANA به روش IIFT در حال حاضر در دسترس هستند که اساس عملکرد آن ها در انجام مراحل تست با یکدیگر کمی متفاوت است. این سیستم ها در مواردی نظیر  استفاده از رنگ های متصل به DNA (4′,6-diamidino-2-phenylindole DAPI, propidium iodide PI یا هیچکدام )، سلول های زمینه بکار گرفته شده ( HEp-2 در برابر HEp-20-10)، بازده( تعداد نمونه در ساعت)، تعداد الگوهایی قابل شناسایی، پیش بینی تیتر، اتوماسیون تمامی مراحل از ابتدا تا انتها و سایر خصوصیات نرم افزاری با هم تفاوت دارند.

بعضی از خوانش گرهای اتوماتیک آزمایش ANA به روش IFA دارای مجموعه تصاویر الگوهای مختلف نیز میباشند، که ابزار بسیار خوبی برای آموزش کاربرها می باشد، و همچنین با فراهم کردن امکان قیاس با این مجموعه ها، به تعیین الگوهای تشخیصی کمک می نمایند.

 

جدول 2

خصوصیات دستگاههای اتوماتیک برای تعیین آنتی بادی های هسته ای توسط روش IFA

 

رنگ هسته ای  b	تعداد الگوهای قابل تشخیص a	کاملا اتوماتیک	تعداد نمونه/ساعت	نام سیستم
DAPI	6c	خیر	48-60	Aklides
PI	7 c	بله	90	EUROPattern
فاقد رنگ	7 c	بله	150	Helios
فاقد رنگ	مثبت/منفی	بله	90	Image Navigator
DAPI	5 c	بله	48-60	NOVA View
فاقد رنگ	5 c	خیر	14-48	Zenit G-Sight
فاقد رنگ	مثبت/منفی	بله	96	Cytospot

 

• دستگاه Aklidas: الگوهای سیتوپلاسمیک، هموژنوس، گرانولار، هسته ای، سانترومری و چندین الگوی نقاط هسته ای

• دستگاه Helios: الگوهای سانترومری، سیتوپلاسمی، هموژنوس، غشا هسته ای،  نقاط هسته ای، هسته ای و گرانولار

• دستگاه EUROPattern: هموژنوس، گرانولار، هستکی، سانترومری، نقاط هسته ای، غشای هسته، سایتوپلاسمی

• دستگاه NOVA View: هموژنوس، گرانولار، سانترومری، هستکی، نقاط هسته ای و سایتوپلاسمی

• دستگاه Zenit G-Sight: هموژنوس، هستکی، گرانولار، سانترومری و میتوکندریایی

• رنگ های DAPI یا PI

• قابلیت پیش بینی تیتر

مطالعات اولیه برپایه استفاده از سیستم های تکی اتوماتیک آزمایش ANA به روش IFA یا مجموعه ای از سیستم ها، مقایسه ای  بین خوانش گرهای اتوماتیک و دستی در مورد نمونه های مثبت یا منفی را نشان می دهد که در تعیین الگوهای پایه و گزارش نتیجه برای نمونه هایی که بیش از یک الگو دارند با یکدیگر متفاوت هستند. بیزارو و همکارانش اولین تیمی بودند که صحت تشخیص 6 دستگاه موجود اتوماتیک تشخیص ANA به روش IFA را با یکدیگر مقایسه کردند.

.

اگرچه مراحل کلی برای نتایج مثبت یا منفی قابل قبول بود، عملکرد دستگاه های مختلف در حیطه تشخیص الگوهای معمول (الگوهای هوموجنوس، گرانولار، هستکی، سنترومر، نقاط هسته ای چندتایی، و سیتوپلاسمی)در محدوده 59% تا 79% بوده در حالی که صحت تشخیص دستگاه های فوق  در تفسیر نمونه هایی با بیش از یک الگو، چالش بزرگی محسوب میشد. بنظر می رسد این یافته ها با مشکلات تفاسیر غلط و به ویژه منفی کاذب الگوهای سیتوپلاسمی، نقاط هسته ای، و غشای هسته ای هماهنگی داشتند. برای خوانش گرهای اتوماتیک ANA به روشIFA  ، نتایج نهایی توسط کاربر گزارش میشود. بنابراین، همزمان که خوانش گرهای اتوماتیک نتایج قابل قبول مثبت و منفی را نشان می دهند، تفاسیر ANA توسط فرد و ارتباطات بالینی این آنتی بادی ها با بیماری؛ همچنان چالش برانگیز باقی مانده است. تشخیص صحیح الگوهای ANA در تعیین خصوصیات آنتی بادی های خودایمن و در نتیجه تشخیص بسیار مهم می باشند و از عواقب وخیم تشخیص غلط جلوگیری می نماید. درحالی که خوانش گرهای اتوماتیک ANA به روش IFA نشان داده اند که در تشخیص نتایج مثبت و منفی موفق عمل کرده اند، همچنان عواملی همچون ماده زمینه HEp-2 و آنتی بادی های ثانویه نقش بزرگی در تشخیص الگو و گزارش تیترایفا می کنند. علاوه  بر این، سیستمهای مختلف در تقسیر ANA روی تصاویرHEp-2 با پارامترهای برنامه نویسی مختلفی سرو کار دارند که در نتیجه نهایی تست بی تاثیر نیست.

 

چشم اندازی بر راهکردهای آینده                                            

پیشرفتهای جدید در زمینه تصاویر کامپیوتری بطور زیادی در چگونگی تعیین و اندازه گیری ANA ها در آزمایشگاههای بالینی تاثیر گذاشته است. مطالعات اولیه بر روی خوانش گرهای اتوماتیک IFA که نشان می دهد این دستگاهها عموما قادر به دسته بندی نتایج بضورت مثبت یا منفی هستند بسیار امیدوارکننده است. اما، فهم این موضوع که این خوانش گرها در تشخیص الگوها محدودیت دارند لزوم دخالت فردی و وابستگی تفسیر نتایج به کاربران تکنیکی را گوشزد می سازد. در حالی که این عواقب ممکن است ناشی از فقدان اتفاق نظر در تعیین و دسته بندی الگوها باشد، عدم توانایی نرم افزارهای موجود برای گروه بندی تصاویر بطور صحیح را نیز نمی توان  بی تاثیر دانست. عدم توانایی خوانش گرها در تشخیص الگوهای ANA با روش اتوماتیک گویای نیاز به تلاش و کوشش برای بهینه سازی خوانش گرهای اتوماتیک است. تلفیق دستورالعملهای جدید برای دسته بندی و نامگذاری ANA، بهمراه تعیین سوبسترای آزمایش قابل قبول (برای مثال سلول های HEp-2 بعنوان ماده زمینه) ،و استانداردسازی تکنیک های گرفتن و دسته بندی تصاویر با چارتهای نسل جدید ممکن است به بهبود تشخیص الگوها کمک نماید. در این فاصله، آزمایشگاهها باید روی آموزش کاربران و جمع آوری مجموعه ای  ازتصاویربراساس راهنمای ارزیابی ANA، در جهت پیشرفت دسته بندی بالینی بیماران تمرکز نمایند. کارگاه هایی برای آموزش متخصصین آزمایشگاه های بالینی ، نرم افزارهای تجدید نظرشده برای تعیین صحیح الگوهای ANA ، و تشکیل برنامه های تخصصی برای بهینه سازی تعیین و اندازه گیری ANA نیز میتواند در این امر مفید باشد.