وجود آنتی بادی های خود ایمن مشخصه بسیاری از بیماری های خود ایمن می باشد. تعیین این آنتی بادی ها ، اینکه بیماری زا باشند یا فقط مشخصه وجود بیماری باشند، در تشخیص بسیاری از بیماری های خود ایمن به نظر مفید می رسد. تعداد اتو آنتی ژن های شناخته شده به عنوان هدف برای آنتی بادی های خود ایمن بطور پیوسته در طول سال ها در حال افزایش می باشد. این موضوع نه تنها در برگیرنده آنتی بادی های خود ایمنی می باشد که امروزه در بیماری های خود ایمن جدید شناخته می شوند، بلکه شامل آنتی بادی های موجود در بیماری های خود ایمن که زیرگروه های آنها به خوبی شناخته شده نیز می باشد.  برای مدت طولانی، اختصاصیت آنتی ژن- آنتی بادی های خود ایمن بطور اولیه توسط آزمون های اختصاصی تکی همچون الایزا و رادیو ایمونواسی   تعیین می گردید. در مواردی که تعیین چندین آنتی بادی برای یک گروه از بیماری های مرتبط مورد نیاز بود، غربالگری توسط روش ایمونوفلورسنت غیرمستقیم برروی سلول ها یا بافت گام اولیه موثری در نظر گرفته می شد. این روش حتی بعنوان روش استاندارد طلایی برای بیماری های روماتوئیدی سیستمیک خودایمن و واسکولیت های وابسته به آنکا  در نظر گرفته شد. برای SARD ، حضور آنتی بادی های ضد هسته ای ANA توسط روش IFA روی سلول های HEp-2 تعیین می گردد. در صورت مثبت بودن ،اکثر آزمایشگاه ها واکنش پذیری با آنتی ژن های هسته ای مشخص

چندگانه قابل استخراج (ENA) را مورد بررسی قرار می دهند، که این کار را یا بطور مستقیم در آزمون های اختصاصی تکی یا ابتدا با پیش غربالگری توسط مخلوطی از ENA های مربوطه انجام می دهند. بطور واضح، تلفیق این آزمون های اختصاصی تکی در یک آزمون چند پارامتری امتیازات منطقی زیادی را در بر دارد. بدلیل افزایش لیست آنتی بادی های خود ایمن این رویکرد تا حد زیادی برای سایر بیماری های خود ایمن نیز مناسب می باشد اما بطور واضح مشکلاتی را نیز شامل می شود.

آزمون های چند پارامتری بعنوان ایمونواسی هایی که تعیین صریح و واضح واکنش آنتی بادی های خود ایمن علیه یک آنتی ژن را ممکن می سازند، در نظر گرفته می شوند. این آزمون ها شامل ایمونواسی ALBIA و ایمونواسی خطی یا نقطه ای (LIA/DIA) می باشند. اگر یک آزمون براساس مخلوطی از آنتی ژن های شناخته/ یا ناشناخته باشد ، بطور نمونه IIF یا وسترن بلات، این آزمون بعنوان یک ایمونواسی چند پارامتری در نظر گرفته نمی شود زیرا هویت آنتی ژن شناخته شده مشخص نیست. از طرف دیگر، آزمون های IIF جدید که تعیین چندین آنتی ژن اختصاصی تکی را مقدور می سازند در دسته آزمون های چند پارامتری قرار می گیرند.

در این مقاله، ابتدا، روش انجام کار آزمون های چند پارامتری مشخص توضیح داده می شود. این توضیح محدود به آزمون هایی می باشد که در حال حاضر در دسترس آزمایشگاه های تشخیصی روتین می باشند و تکنولوژی های آزمایشی را شامل نمی گردد. ثانیاً، قابلیت کاربری تکنولوژی چند پارامتری برای تشخیص بیماری های خود ایمن مورد بحث قرار می گیرد. در آخر، محدودیت های روش چندپارامتری به منظور افزایش آگاهی اینکه مشخصات آزمایش هر آنتی ژن برای تفسیر مناسب درمحتوای بالینی بیمار تحت بررسی باید شناخته شود مورد بحث قرار می گیرد .

 

 

روشهای شاخص ایمونواسی های چندپارامتری

روش ALBIA مخلوطی از بید های نشان دار شده با آنتی ژن را با یک فلورسنت داخلی ساطع شده توسط بید بکار می گیرد (عکس 1.A) . بنابراین، هر جمعیت بید یک ایمونواسی مجزا را ارائه می دهد. به محض انکوبه شدن با نمونه سرم، آنتی بادی های خود ایمن مربوطه به بید ها متصل شده و آنتی بادی های غیر اختصاصی توسط مرحله شستشو جدا می شوند. سپس، بید ها با محلول ایمونوگلوبولین آنتی هیومن فلورسنت انکوبه شده و وجود آنتی بادی های خود ایمن به وسیله فلوسایتومتری مورد ارزیابی قرار می گیرند. با استفاده از استاندارد های آنتی بادی های خودایمن در غلظت های مختلف، یک منحنی کالیبراسیون از شدت سیگنال ها می تواند بدست آید، و سپس منحنی برای تعیین غلظت آنتی بادی های خود ایمن در نمونه های مورد آزمایش به کار گرفته شود. بعلت فقدان رفرانس های بین المللی برای اکثر آنتی بادی ها، نتایج عموماً بصورت واحد های اختیاری گزارش می شوند. در مجموع، ALBIA میزان چندین آنتی بادی خودایمن را بطور همزمان و بطور متمایز اندازه گیری می نماید. این روش می تواند یا در یک پلاتفرم و یا دو پلاتفرم بطور کامل اتوماتیک گردد و بنابراین برای مقادیر زیاد نمونه بسیار مناسب می باشد.

                                                                                                                                                   

عکس 1. روشهای شاخص آیمونواسی های چندپارامتری

 

نکات: روش هایی که در حال حاضر در آزمایشگاه های تشخیصی روتین در دسترس هستند : ایمونواسی لیزر بید (A)، ایمونواسی خطی و نقطه ای (B)، و ایمونوفلورسنت غیرمستقیم(C) می باشند. تمام آزمون ها براساس انکوبه با سرم بیمار در اولین مرحله می باشند، در مرحله دوم انکوباسیون با کونژوگه ایمونوگلوبولین آنتی هیومن، و در ایمونواسی خطی و نقطه ای (B)، سومین مرحله تعیین محصول واکنش. 

 

دومین نوع ایمونواسی های چندپارامتری شامل LIA و DIA می باشد. از این آزمون ها اغلب بطور اشتباه به عنوان بلات های خطی و نقطه ای یاد می شود. اما، در هردو مورد، آنتی ژن بطور مستقیم به غشاء جاذب بدون الکتروفورز یا بلاتینگ قبلی انتقال داده می شود (عکس 1B). در مورد DIA، آنتی ژن بصورت نقطه ای روی غشاء قرار داده می شود، در حالیکه در روش LIA آنتی ژن بصورت یک خط صاف روی غشاء به اصطلاح نقاشی می شود. در مقایسه با وسترن بلات، هردو روش DIA و LIA  استفاده از شرایط اتصال متمایز برای هر آنتی ژن جداگانه به غشاء را بکار می گیرند. همچنین انتخاب آنتی ژن های ذاتی یا نوترکیب برای هرآنتی ژن آزاد می باشد. قطعات مجزای غشاء، شامل آنتی ژن های مختلف، می تواند روی یک فویل سنتز شده حامل چسبانده شود. نوار با سرم بیمار انکوبه می شود. بسته به وجود آنتی بادی ها برای آنتی ژن مرتبط روی نوار، کمپلکس آنتی ژن – آنتی بادی شکل می گیرد. این کمپلکس ها بوسیله محلول ایمونوگلوبولین آنتی هیومن که به یک آنزیم متصل شده و متعاقباً توسط سوبسترای مناسب قابل رویت می گردند، شناسایی می شود. مراحل انکوباسیون می تواند بصورت اتوماتیک انجام پذیرد اگرچه در بعضی موارد نمونه برداری دستی از سرم بیماران لازم می گردد. بنابراین ، این تکنیک برای آزمایشاتی با حجم بالا مناسب نیستند، اما در عوض برای آزمایشگاه هایی که تعداد نمونه ها کم یا متوسط هستند بسیار مناسب می باشد. خوانش نتایج نیز می تواند بصورت اتوماتیک انجام پذیرد و شدت رنگ باندها/ نقطه ها مورد ارزیابی قرار گیرد تا تعیین نیمه کمی آنتی بادی های خود ایمن امکان پذیر گردد.

اگرچه روش IIF ابتدا بر اساس تعیین آنتی بادی های خود ایمنی که به سلول  یا بافت متصل می شوند بود، پیشرفت های جدید تلفیق آزمون اولیه با تست های آنتی ژن- اختصاصی را ممکن ساخته اند، پیشرفت های جدید تلفیق آزمایش اولیه با آزمایش های آنتی ژن-اختصاصی را ممکن ساخته اند (عکس 1C). روش سیتوبید (Generic Assays, Berlin, Germany) غربالگری آنتی بادی های خود ایمن توسط ماده زمینه سلولی را با ایمونواسی چند پارامتری ذرات ریز تلفیق نموده است. بید هایی که با آنتی ژن های مختلف پوشیده شده اند می توانند توسط اندازه و جایگاهشان در یکی از چهار لایه ای که قسمت مرکزی را احاطه کرده اند شناسایی گردند. روش بیوچیپ (Euroimmun, Lübeck, Germany) همچنین ترکیبی از مواد زمینه ای چندگانه را در یک  فیلد انکوباسیون امکان پذیر می سازد. این مواد زمینه ای ممکن است شامل ترکیبی از سلول ها، بافت ها، آنتی ژن های نقطه ای، یا سلول های آلوده شده باشند. بطور خاص، سلول های آلوده شده به نظر می رسد برای تعیین آنتی بادی های خود ایمن به گیرنده های غشایی بسیار مناسب باشند. برای تعیین آنتی بادی های خود ایمن توسط روش IIF، نمونه های سرم با آنتی ژن زمینه بر روی لام های میکروسکوپی انکوبه شده تا به آنتی بادی های خودایمن اجازه اتصال داده شود. آنتی ژن زمینه ممکن است یا در مجاورت هوا خشک شده باشد و یا توسط فیکساتیو ها تهیه شده باشد تا امکان اتصال آنتی بادی های خود ایمن را فراهم آورد. بعد از مرحله شستشو ، آنتی بادی های غیر اختصاصی حذف می گردند و لام با یک محلول ایمونوگلوبولین انسانی متصل به ایزوتیوسیانات فلورسئین انکوبه می گردد. کمپلکس سه قسمتی باقی مانده آخری، که شامل آنتی بادی ثانویه فلورسنت دار، آنتی بادی خودایمن و آنتی ژن می باشد، توسط یک میکروسکوپ فلورسنت قابل مشاهده می باشد. نتایج بدست آمده از روش IIF بوسیله رقت سازی سری از سرم و یا توسط آنالیز کمی تصاویر قابل اندازه گیری کمی (نیمه کمی) می باشند. تکنیک جدیدتر فلورسنت نمونه های بیمار را در مقایسه با شدت کالیبراتورهای استاندارد اندازه می گیرد و مستقیماً شدت را تبدیل به تیتر آنتی بادی می نماید. اخیراً دستگاه های تشخیص الگو موجود می باشند که خوانش اتوماتیک این آزمون های چند پارامتری IIF را ممکن می سازند. با دستگاه های تمام اتوماتیک حجم متوسط تا بالای نمونه قابل بررسی می باشد. در روش سیتو بید اختصاصی آنکا حتی نتایج کمی با استفاده از منحنی استاندارد بر اساس سرم های رفرانس مرکز بین المللی پیشگیری و کنترل بیماری ها (CDC) بدست می آید.

اساساً، آزمون های چند پارامتری برای تعیین آنتی بادی های خود ایمن می توانند برای هر نوع بیماری خود ایمن یا گروهی از بیماری های خود ایمن که با بیش از یک نوع آنتی بادی همراه هستند بکار روند. این بیماری ها و آنتی ژن های مرتبط با آنها در جدول 1 و 2 خلاصه شده اند. برای بعضی بیماری ها، آزمون های چند پارامتری هنوز در دسترس نیستند. این موضوع در مورد بیماری هایی چون دیابت شیرین نوع 1 (DM)، میاستنی گراویس (MG)، و بیماری های خود ایمن تیروئید صدق می کند که در این ها حداقل یک آنتی ژن مرتبط بالینی به ترتیب، بعنوان مثال، گلوتامیک اسید دی کربوکسیلات (GAD)، گیرنده استیل کولین (AChR)، و گیرنده هورمون محرکه تیروئید (TSH-R)، نیازمند روشی می باشد که با آزمون های چند پارامتری موجود هم خوانی ندارد. در این راستا لازم است ذکر شود که چندین آزمون پارامتریک از آنتی ژن های نوترکیب استفاده می کنند که به طور کامل اپی توپ آنتی ژن های ذاتی را ارائه نمی دهند. این موضوع در مورد سه آنتی ژنی که ذکر شد صدق می کند اما ممکن است برای سایر آنتی ژن های خود ایمن به کار گرفته شده در آزمون های تعیین آنتی بادی های خود ایمن نیز صادق باشد. بطور مشخص این مشکل محدود به آزمون های چند پارامتری نمی باشد. ثانیاً، تشخیص آرتریت روماتوئید (RA) براساس تعیین آنتی بادی خود ایمن در آزمایش های تک اختصاصی می باشد زیرا آنتی بادی های خود ایمن موجود در خصوصیات طبقه بندی از ایزوتوپ های مختلفی از جمله آنتی بادی های IgM روماتوئید فاکتور و IgG پروتئین anti-citrullinated می باشند. اگرچه از لحاظ تکنیکی امکان پذیر است که مواد تشخیصی متفاوتی که با فلوئوروکروم های متمایز کونژوگه شده اند در فلوسایتومتری (ALBIA) و میکروسکوپ فلورسانس (IIF) به کار گرفته شوند اما چنین کاربردی در تنظیمات روزمره به آسانی قابل دسترس نیست. نیاز تشخیصی برای تعیین آنتی بادی های خود ایمن با ایزوتوپ های متمایز محدود به RA نمی باشد، و در مورد سندرم آنتی فسفولیپید (APS) ، سندرم گیلین باره و سندرم فیشر- میلر (GBS/MFS) و به میزان کمتر در بیماری سیلیاک نیز صدق می کند. به خصوص APS و GBS/MFS از تشخیص همزمان ایزوتوپ های متمایز آنتی بادی نفع می برند. در آخر، آزمون های IIF موجود در حال حاضر که باعث تعیین آنتی بادی های خود ایمن چند تایی در بیماری سیلیاک و بیماری های خود ایمن تیروئید می گردند بعنوان آزمون های چند پارامتری در نظر گرفته نمی شوند، زیرا در هر دو مورد یک آنتی بادی خود ایمن در بافت و دیگری روی آنتی ژن- اختصاصی نقطه ای تشخیص داده می شوند. بنابراین، در مورد این آزمون ها توضیح بیشتری نخواهیم داد.

 

                                                                                                                                     

جدول 1. بررسی اجمالی بیماری های خود ایمن سیستمیک که نیاز به تعیین آنتی بادی های خودایمن چند تایی دارند

Abbreviations: AAV, ANCA-associated vasculitis; ACPA, anti-citrullinated protein antibodies; ALBIA, addressable laser bead immunoassay; APS, anti-phospholipid syndrome; DIA, dot immunoassay; IIF, indirect immunofluorescence; IIM, idiopathic inflammatory myopathies; LIA, line immunoassay; NA, not available; RA, rheumatoid arthritis; RF, rheumatoid factor; SARD, systemic autoimmune rheumatic diseases; SSc, systemic sclerosis; SLICC, Systemic Lupus International Collaborating Clinics; SLE, systemic lupus erythematosus; Ig, immunoglobulin.

 

                                                                                                       

جدول 2. بررسی اجمالی بیماری های خود ایمن وابسته به عضو که نیاز به تعیین آنتی بادی های خود ایمن چند تایی دارند.

Abbreviations: AID, autoimmune disease; AIG, autoimmune gastritis; AIH, autoimmune hepatitis; ALBIA, addressable laser bead immunoassay; APCA, anti-parietal cell antibodies; DIA, dot immunoassay; DM, diabetes mellitus; GBS, Guillain–Barré syndrome; IIF, indirect immunofluorescence; LIA, line immunoassay; MFS, Miller–Fisher syndrome; MG, myasthenia gravis; NA, not available; PA, pernicious anemia; PBC, primary biliary cirrhosis; PDC, pyruvate dehydrogenase complex; PNS, paraneoplastic neurological syndrome