تکنیک MLPA

اساس روش MLPA بر پایه هیبرید شدن به صورت اختصاصی می باشد، به طوری که حتی تغییر یک نوکلئوتید در محل اتصال ۲ پروب قابل شناسایی است. با استفاده از مجموعه ای از پروب ها که هر کدام شامل دوالیگونوکلئوتید و مکمل ناحیه مشخصی از ژنوم می باشند، تعداد نسخه ژنی در 40تا 50 محل مختلف را می توان در یک واکنش ساده PCR مشخص نمود. امروزه  MLPA در زمینه های مختلفی مانند شناسایی سرطان ها، تشخیص ناقلین و افراد مبتلا به بیماری های ژنتیک ، به خصوص  آلفا تالاسمی، بتا تالاسمی و دیستروفی عضلانی دوشن و... به کار می رود. این تکنیک برای تشخیص سریع بیماری های ژنتیکی قبل از تولد مانند سندرم داون ، تریزومی ١٨ یا تریزومی ١٣ و سایر ناهنجاری های کروموزومی بر روی نمونه های آمنیوسنتز و یا پرزهای جفتی (CVS) کاربرد وسیعی دارد.

 در شرایطی که زمان برای ختم بارداری واقعاً محدود باشد، به وسیله تکنیک های MLPA و QFPCR این امکان وجود دارد تا در مدت یک روز وضعیت جنین از نظر ناهنجاری های شایع کروموزومی بررسی شود.

 

مزایای استفاده از  MLPA

1. در یک واکنش PCR امکان بررسی همزمان 50 محل مختلف ژنومی

2. نیاز به میزان کم DNA

3. سرعت جوابدهی بالا

4. هزینه بسیار مناسب

5. به علت اختصاصی بودن بالا، دارای دقت بالا

6. استفاده از یک جفت پرایمر

 

کاربرد روش MLPA

1.  بررسی del/dup در ژنوم

2.  بررسی تعداد نسخه ژنی جهت screening

3.  بررسی جهش های نقطه ای و پلی مورفیسم های (SNP’s)

4. بررسی وضعیت متیلاسیون مناطق پروموتری و یا imprinted

5. تشخیص آنیوپلوئیدی

 

مزیت روش MLPA نسبت به دیگر روش ها

1. به وسیله این تکنیک می توان تعداد نسخه ژنی (deletion,duplication) را به راحتی و سریع مشخص کرد، در صورتیکه  Real-time PCR دارای حساسیت کم برای تغییرات کوچک است و باید محل  حذف و یا اضافه شدگی ها مشخص باشد.

2. برای تشخیص جهش های نقطه ای که از روش های تعیین توالی مانند SSCP ، DHPLCو... استفاده می شود، این تکنیک ها قادربه شناسایی تغییرات تعداد نسخه ژنی در حد یک اگزون کامل نیستند.

3. تکنیک FISH قادر به تشخیص جهش های کوچک نمی باشد.

4.  Southern blots تنها قادربه تشخیص حذف های تا چند کیلو باز است که نیازمند به مقدار DNA با غلظت ومیزان بالا و پروب های رادیو اکتیو که بسیار زمان بر و پر هزینه است .

 

(Methilation Spesific-MLPA) MS-MLPA

  در این روش تغییرات متیلاسیون علاوه بر تغییرات تعدادی در یک واکنش انجام می شود، کاربرد این روش در بیماری های با تغییرات اپی ژنتیکی و علامت گذاری ژنومی (Imprinting) می باشد، از جمله در مواردی مانند سندروم های پرادرویلی/آنجلمن و بک ویت وایدمن/راسل سیلور استفاده می شود. در این روش در صورت متیلاسیون نقطه مورد نظر امکان برش آنزیمی وجود ندارد و در نهایت پروب ها به یکدیگر منتقل شده و محصول PCR وجود خواهد داشت.

 

روش انجام MLPA:

 تکنیک MLPA شـامل ٥ مرحله است :

 1- واسرشته کردن DNA و واکنش هیبریداسیون بـین رشـته های DNA و مخلوط پروب‌ها

 2- واکنش چسبیدن به وسـیله آنـزیم لیگاز

 3- انجام واکنش PCR با پرایمرهای نشاندار

 4- جداسـازی قطعات با روش الکتروفورز

5- آنالیز یافته ها

 

 نخست، رشته های  DNAدر شرایط گرمـائی ازهم جدا می شوند. برای هیبرید شدن پروب‌هـا بـا تـوالی مکمـل خـود ، مخلوط DNA و پروب ها به مدت یک شب در شـرایط دمـائی مناسب در روی رشته DNA قرار می گیرند. در انتهای '5 هر یـک از پـروب‌هـا توالی مکمل پرایمرهای مشترک لازم برای انجـام PCR اضـافه گردیده است. این پروب ها در مرحله هیبرید در کنـار هـم بـه توالی هدف در روی الگـو جفـت شـده و در صـورتی کـه الگـو طبیعی و جفت شدن کامل باشد توسط آنـزیم لیگـاز بـه هـم چسبانده می شوند. تنها آن گروه از رشته های پـروب کـه در کنار هم جفت شده و بهم متصل شده باشند در طـی واکـنش PCR، آمادگی تکثیر شدن دارند.اگر پروب‌ها به توالی هـدف نچسـبند واکـنش چسـباندن آنزیمـی صورت نپذیرفته و در واکنش PCR، پـروب مربـوط بـه ناحیـه مذکور تکثیر نخواهد شد. قطعات ناشـی از تکثیـر پـروب هـای جفـت متصل شده توسط تکنیک الکتروفورز در لولـه هـای موئینـه بررسـی مـی شوند. نتیجه، منحنی‌هائی خواهد بود که نسبت ارتفاع و سطح زیرین منحنی ها در قیاس با منحنی های کنترل بیانگر تعـداد نسخه های غیر طبیعی الگوهـای تکثیـر شـده اسـت.

References:

 

Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002). "Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification". Nucleic Acids Res. 30 (12): e57. doi:10.1093/nar/gnf056. PMC 117299 . PMID 12060695.

 Illanes S, Avent N, Soothill PW (2005). "Cell-free fetal DNA in maternal plasma: an important advance to link fetal genetics to obstetric ultrasound". Ultrasound Obstet. Gynecol. 25 (4): 317–322. doi:10.1002/uog.1881. PMID 15789415

Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch A, Zschocke J. MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics. 2005;6:29-35

retardation. Genet Med. 2007;9:117-12  screening method for the detection of micro-duplications and microdeletions in patients with X-linked mental  Madrigal I, Rodriguez-Revenga L, Badenas C, Sanchez A, Martinez F, Fernandez I, et al. MLPA as first

Applications of multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) method in diagnosis of cancer and genetic disorders

M.R Noori Daloii PhD , F Khordadpoor-Deilamani MSc