در این تحقیق، شیوع و اهمیت تشخیصی اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 در یک بیمارستان روی گروهی از بیماران که تحت آزمایش روتین ANA قرار گرفتند مورد بررسی قرار گرفت. غربالگری ANA روی سلول های HEp-20-10 با استفاده از ایمونوفلورسنت غیرمستقیم انجام و به دنبال آن پروفایل  anti-extractable nuclear antigen) ENA) با استفاده از ایمونواسی خطی چند پارامتری (LIA)  انجام گردید. از 6511 بیمار مورد آزمایش ANA در سال 2016، الگوی DFS در 1758(27%) مشخص گردید، که 720(41%) توسط LIA برای آنتی DFS70 مثبت تشخیص داده شدند. از این تعداد، 526 (73.1%) بیمار واکنش آنتی DFS70 ایزوله نشان دادند، درحالیکه 194(26.9%) ویژگیهای سایر ENA را نشان دادند. در بین 1038(25%) نمونه آنتی DFS70 منفی یا مرزی، 778(75%) پروفایل ENA منفی داشتند در حالیکه 260(25%) باقیمانده، حضور مختلفی از سایر ویژگیهای ENA ها نشان دادند. بررسی نمودارهای بیماران با آنتی DFS70 ایزوله تایید کرد که بیماری های SARD مرتبط با ANA در غیاب شواهد بالینی یا سایر ویژگیهای ENA ها نادر است، و در حال حاضر هیچ موردی وجود ندارد. بیماران آرتریت روماتوئیدی در بعضی موارد دارای ANA آنتی DFS70 ایزوله بودند و فاکتورهای روماتوئیدی  و آنتی بادی های پپتیدی سیترولینه آنتی سیکلیک آنها نیزمثبت بود. بعنوان نتیجه، تعیین الگوی DFS ANA با استفاده از سلولهای HEp-2 بعنوان ماده زمینه، و بدنبال آن تایید توسط آنتی DFS اختصاصی باید بعنوان یک روش روتین در آزمایش ANA در نظر گرفته شود. استفاده از یک پروفایل کامل ENA وارتباط بالینی برای تایید اینکه آنتی DFS70 "ایزوله" علت یک ANA است لازم میباشد. تعیین آنتی DFS70 ایزوله باعث اطمینان از بعید بودن بیماری SARD است، بنابراین از ارجاع برای آزمایش های بیشتراجتناب میگردد. حضور افزایش قابل ملاحظه سایر ENA ها ممکن است منعکس کننده SARD باشد و رابطه بالینی نزدیک و پیگیری را ضمانت نماید.  

مقدمه

وجود آنتی بادی های آنتی نوکلئار(ANA) یکی از مشخصه های کلیدی تشخیص بیماری‌های روماتوئیدی خودایمن سیستمیک (SARD) از جمله لوپوس اریتماتوز سیستمیک (SLE) ، سندرم شوگرن، اسکلوزان سیستمیک، درماتومیوزیت/پلی میوزیت (DM/PM) ، بیماری های بافت پیوندی مختلط  و غیره می باشد. ایمونوفلورسنت غیرمستقیم (IIF)  با استفاده از سلولهای اپی تلیال انسانی (HEp-2) بعنوان روش "گلد استاندارد" برای غربالگری ANA بکار میرود، بدلیل اینکه این ماده زمینه بیش از 100 اتوآنتی ژن اختصاصی  شامل پروتئین ها، DNA و ریبونوکلئوپروتئین ها را در بر دارد.
الگوی دنس فاین اسپیکل (DFS) یکی از شایع ترین الگوی فلورسنتی در غربالگری روتین ANA در آزمایشگاههای بالینی محسوب می شود که اغلب در تیترهای بسیار بالا دیده می شود. اتوآنتی بادی های مولد این الگو پروتئین 70 کیلو دالتونی DFS (DFS70) را مورد هدف قرار داده، که کاملا مشابه LEDGFp75  می باشد. این  DFS70/LEDGFp75 باعث محافظت سلولی بوسیله تنظیم رونویسی ژنهای مرتبط با استرس می شود که مرتبط با پاتوفیزیولوژی ایدز، سرطان، خودایمنی، و شرایط التهابی می‌باشد. اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 ممکن است نقش محافظتی، بیماری زایی، یا حسی داشته باشند. کمیته مجمع بین المللی برای الگوهای ANA (ICAP)  اخیرا الگوی DFS را بعنوان الگوی تشخیص سطح  با تجربه "AC-2" دسته بندی نموده است که با رنگ آمیزی دنس یا هتروجنوس اسپیکل دار در نوکلئوپلاسم سلول های اینترفازو صفحه کروموزومی متافاز توصیف می گردد. تشخیص این الگو روی سلول های HEp-2 چالش برانگیز است زیرا ممکن است با سایر الگوهای نوکلئار اشتباه شود و یا ممکن است در چارچوب ANA مرتبط دیگری از لحاظ بالینی قرار گیرد و به همین دلیل تقسیر IIF وابسته به تجربه تکنیسین دارد. بنابراین، نتیجه مثبت DFS IIF باید توسط یک ایمونواسی تک –اختصاصی  (همچون ELISA، CLIA، ایمونوبلات، ایمونوابزوربشن ) دنبال گردد تا همانطور که در الگوریتم تشخیصی توصیه گردیده است وجود اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 بطور صحیح تایید گردند.
اهمیت بالینی اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 بدلیل عدم وجود ویژگی بیماری مشخص نمیباشد. بدون در نظر گرفتن روش تعیین، آنتی بادی های DFS ANA و یا آنتی DFS70 با شیوع بالایی در افراد ظاهرا سالم تعیین شده است (%21.6-0)، و همچنین در گروههای روتین غربالگری ANA (%16.6-0.3)، و انواع التهابات غیر SARD و در  موارد بدخیمی ها (%71.4-3.3 : بطور مثال سندرم Vogt–Harada، درماتیت اتوپیک ، پسیوریازیس، سیستیت بینابینی، تیروئیدیت هاشیموتو، بیماری های چشمی، سندرم خستگی مزمن آسم ، یا سرطان پروستات). در مقایسه، آنها در بیماران دچار SARD نادر هستند (%28.6-0)، و فقط یک شیوع کلی %4.5-2.8 دارد که بطور چشمگیری بسیار کمتر از آنچه در افراد سالم و گروههای کنترل دیده می شود است. واکنش آنتی DFS70 در SARD معمولا همراه با سایر آنتی بادی های مرتبط با SARD می باشد، که واکنش آنتی DFS70  ایزوله در SARD تنها به مقادیر %0.7-0.5 گزارش شده است. بنابراین، آتنی بادی های علیه DFS70 ، بخصوص در غیاب ANA مرتبط بالینی، بطور زیادی بعنوان بیومارکر پیش بینی منفی برای رد تشخیص SARD مورد توجه قرار می گیرند. این موضوع توسط تحقیقات گزارش شده بر روی افراد سالم با واکنش آنتی DFS70 ایزوله که با یک پیگیری 3-4 ساله (خودایمنی خوش خیم) به بیماری های SARD دچار نشدند پشتیبانی گردید.

چندین نظر سنجی اخیر شیوع DFS ANA را در سرم های ارسال شده برای غربالگری روتین ANA مورد بررسی قرار داده است، اما تنها بعضی از این ها از آزمون های anti-DFS70 برای تایید اختصاصیت آنتی بادی در تمام یا فقط یک زیر مجموعه از نمونه های مورد آزمایش استفاده نمودند. با در نظر گرفتن ترکیب متنوع گروه های مورد آزمایش و تفاوت آزمون ها و تفاسیر IIF، اطلاعات موجود در حال حاضر بایستی با احتیاط تفسیر گردند. بنابراین، هدف این تحقیق بررسی فراوانی اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 در میان سرم های متوالی معرفی شده برای آزمایش ANA در یک آزمایشگاه بیمارستان محلی با استفاده از روش IIF روی سلول های HEp-20-10 برای غربالگری آنتی بادی و بدنبال آن یک ایمونواسی خطی چندپارامتری (LIA) برای تایید یا عدم تایید وجود آنتی DFS70 و یا سایر اتوآنتی بادی ها در تمامی نمونه هاییکه دارای الگوی DFS ANA بودند میباشد.  برسی نمودار پرونده های پزشکی و پیگیری بالینی برای ارزیابی انجمن های بالینی مرتبط و ارتباط تشخیصی مجاز است.

روش انجام کار

بیماران و نمونه های سرمی ما 6511 نمونه  سرم از بیماران مراجعه کننده به مرکز پزشکی  Lexington، یک بیمارستان 400 تختی با سرویس روماتولوژی قوی، در کلمبیای غربی، آمریکا، را مورد مطالعه قرار دادیم. این نمونه ها برای آزمایش روتین ANA در طول یک سال جمع آوری گردیدند. آنالیزهای سرولوژیکی بدون توجه به اطلاعات بالینی انجام گرفتند.

آزمون IIF

غربالگری ANA با استفاده از کیت IFA40: HEp-20-10 (Euroimmun, Luebeck, Germany) انجام گرفت. آزمایش و ارزیابی مطابق دستورالعمل سازنده انجام پذیرفت. اسلایدها توسط دو فرد بطور مجزا با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مورد ارزیابی قرار گرفتند. تمامی نتایج الگوهای DFS ANA بعنوان احتمالا مرتبط با DFS70 ، همراه با پیگیری آنالیزENA توصیه شده، گزارش شده است.

آزمون ایمونوبلات

پروفایل اختصاصی برای اتوآنتی بادی های آنتی ENA با استفاده از کیت EUROLINE ANA profile 3 plus DFS70 (IgG) مطایق دستورالعمل سازنده ( Euroimmun)  انجام گرفت. نوارها شامل 16 آنتی ژن مجزا که 11 مورد  از آنها پروتئینهای طبیعی خالص شده می باشند ( nRNP/Sm، SS-A ، SS-B ، Scl-70،Jo-1، dsDNA، نوکلئوزوم ها، هیستون ها، پروتئین P ریبوزومی، و AMA M2)و 5 مورد دیگر آنتی ژن های نوترکیب می باشند (Ro-52،PM-Scl، CENT B، PCNA، و DFS70). آنتی ژن DFS70 یک پروتئین نوترکیب با طول کامل (آمینواسید 530-1 ) می باشد که بر روی سلول های پستانداران ظاهر می شود. سیستم  EUROBlotOne  از شرکت Euroimmun بصورت اتوماتیک برای تمامی مراحل انکوباسیون و شستشو بکار گرفته شد. نوارها با سرم رقیق شده به نسبت 1:101 بمدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. بعد از سه مرحله شستشوی 5 دقیقه ای ، اتصال آنتی بادی های اختصاصی توسط انکوباسیون با کونژوگه آلکالن فسفاتاز   goat anti-human IgG  که بمدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند تعیین گردید. بدنبال آن، نوارها شسته شده و سپس با NBT/BCIP بمدت 10 دقیقه انکوبه شده و سپس برای متوقف شدن واکنش با آب مقطر شستشو داده شدند. نوارهای انکوبه شده بطور اتوماتیک خشک گردیده و از آنها عکس گرفته شد. شدت باندهای تشکیل شده توسط نرم افزار  EUROLineScan از شرکت Euroimmun مورد ارزیابی قرار گرفت. شدت سیگنال بیشتر یا مساوی 15 بعنوان مثبت ،بین 14-8 مرزی، و کمتر و مساوی با 7 منفی در نظر گرفته شد.
 

نتایج

غربالگری IIF و تمایز ANA بین 6511 نمونه سرم مورد آزمایش برای ANA در سال 2016، 5339 (82.0%) با تیتر بیشتر یا مساوی 1:40 توسط روش IIF برای ANA مثبت و 1172 (18.0%) منفی (1:40>) شدند. الگوی DFS مطابق سطح AC-2 در 1758 سرم تعیین گردید که این تعداد 27.0% کل سرم های مورد آزمایش و 32.9% سرمهای ANA مثبت محسوب می شد. آنالیز نمونه های مثبت DFS با روش LIA وجود اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 را در 720 (41%) کل نمونه های DFS طبق الگوی AC-2 را نشان داد. از بین اینها، 526 (73.1%) واکنش اختصاصی آنتی DFS70  داشتند درحالیکه 194 (26.9%) باقیمانده مشخصات  سایر ENA ها را نشان دادند. 1038 (59.0%) نمونه با الگوی DFS ANA از لحاظ آنتی DFS70 توسط روش LIA منفی (یا مرزی) بودند که اینها شامل 260 ( 025%)  نمونه با حضور مختلفی از سایر مشخصات ENA و 778 (75%) با پروفایل منفی برای ENA بودند (عکس 1). بنابراین، واکنش اختصاصی آنتی DFS70 در 29.9% تمامی نمونه های مثبت DFS IIF وجود داست که احتمال کم برای وجود یا پیشرفت بیماری های SARD را نشان می دهد (عکس 2).

Figure 1.

Results of antinuclear autoantibody (ANA) testing in 6,511 patients samples, focusing on a subgroup of 1,758 samples with a dense fine speckled (DFS) pattern (AC-2) in indirect immunofluorescence (IIF). The DFS pattern is characterized by staining of dense fine speckles in interphase nuclei and strongly fluorescent mitotic chromosomes. Initial ANA screening was performed using IIF on HEp-20-10 cells. Samples showing a DFS IIF pattern were analyzed for specific autoantibody reactivity using a line immunoassay (LIA) containing 16 relevant antigens. Frequencies (percentage values in brackets) refer to the number of patients in the respective next higher subgroup. (+), positive; (±), borderline; (−), negative

تشخیص های مرتبط با مثبت بودن آنتی  DFS70

بررسی های روماتولوژیستی بیماران آنتی DFS70  مثبت برای مشخص شدن اینکه آیا یافته های واکنش آنتی DFS70  ایزوله یک ابزار مناسب برای رد بیماری های SARD میباشد یا نه انجام پذیرفت. تاکنون هیچ مورد SARD مرتبط با ANA در بین بیماران مثبت از لحاظ اتوآنتی بادی های اختصاصی DFS70 ایزوله در بیمارستان ما یافت نشد. در مقایسه، وجود سایر ENA ها در سطح قابل توجهی ارتباط بالینی خاصی با این اتوآنتی بادی ها ،همانطور که موارد آنها در جدول 1 ذکر گردیده است، دارد. گاها، ما بیماران آرتریت روماتوئیدی با  anti-DFS70 ANA  ایزوله پیدا کردیم که برای عوامل روماتوئیدی و آنتی بادی علیه CCP مثبت بودند.

 

 

Figure 2

Results of autoantibody profiling by line immunoassay in serum samples with a typical dense fine speckled (DFS) pattern (AC-2) in indirect immunofluorescence (IIF). Percentages for anti-DFS70 positive (blue) and negative (red) results by LIA refer to the total number DFS IIF positive cases (green). The likelihood for the presence or development of an associated systemic autoimmune rheumatic disease (SARD), in accordance with Conrad et al. (19), is indicated in the outermost circle (white). (+), positive; (±), borderline; (−), negative

بحث:

در طول سالهای متوالی ما متوجه شدیم که تعداد زیادی نمونه با تیتر بالای فاین اسپیکل ANA دارای پروفایل ENA منفی بوده‌اند. وقتی ماده زمینه ای سلول های HEp-2 که دارای تعداد زیادی سلول در فاز میتوتیکی باشند (HEp-20-10) در دسترس باشد، ما متوجه شدیم که اغلب این فاین اسپیکل ANA ها یک فلورسنت مثبت میتوتیکی را نیز نشان می دهند یعنی یک الگوی مخلوط اسپیکل دار/هوموجنوس که بعدها بعنوان "دنس فاین اسپیکل دار" نامیده شد که اغلب همراه با خصوصیت آنتی DFS70 بود. برخلاف این واقعیت که الگوی DFS IIF اخیرا برای سطح مجرب توسط ICAP (الگوی AC-2)، بدلیل همراهی منفی آن با SARD ، دسته بندی شده، همچنان بین آزمایشگاهها بطور گسترده تشخیص داده نمی شود و اغلب بعنوان "اسپیکل دار"، " هوموجنوس" با حتی "منفی" گزارش داده میشود و هیچ آزمایشی متعاقب آن انجام نمی پذیرد. اما، آزمایشات تکمیلی به این دلیل که تشخیص الگوی DFS چالش پذیر است واحتمال اشتباه وجود دارد. در این تحقیق، ما شیوع اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 و همراهی آنها با بیماری های SARD مرتبط با ANA را در یک بیمارستان محلی از افرادیکه بطور روتین برای آزمایش ANA معرفی می شدند با استفاده از یک پروفایل ENA گسترده برای پیگیری نمونه هاییکه الگوی DFS IIF داشتند مورد آزمایش قرار دادیم.
ما الگوی DFS IIF را در 27.0% تمام نمونه های معرفی شده برای غربالگری ANA مشاهده نمودیم. سایر گروهها وجود این الگو را در 16.6-0.3% از گروه غیرانتخابی روتین ANA گزارش داده اند که در نتیجه شیوع کلی آن حدود 7.7% ،همانطور که در جدول 2 ذکر گردیده است، می باشد. دلایل این آمار مثبت بیشتر براساس حدسیات میباشد که شامل هتروژن بودن و ترکیب بندی گروههای مورد مطالعه غربالگری ANA (بطور مثال جنس، سن، نژاد، دلیل برای درخواست آزمایش ANA) و یا اختلاف روشهای غربالگری و تعیین میزان کات آف مناسب برای آزمایش می باشد. قابل توجه است که عملکرد تحلیلی HEp-2 IIF بطور زیادی وابسته به کیفیت ماده زمینه ای و کیت، خصوصا نسبت سلول های فاز میتوتیک به سلول های فاز اینترفاز، مورفولوژی سلول، قابلیت تکثیر، و خطی بودن رقیق سازی می باشد. گزارش شده است که ماده زمینه HEp-20-10 ( گونه ای از سلول های HEp-2 با ده برابر سلول در فاز میتویتک) که در این تحقیق بکار گرفته شد، تشخیص، تمایز و تخمین تیتر الگوی ANA  را آسانتر می سازد.

جدای از سختی تشخیص الگوی DFS IIF ، شیوع بالای اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 در افراد سالم، فقدان ارتباط با گروه بیماری خاصی، و همراهی منفی با SARD  تایید واکنش آنتی DFS70 را مورد نیاز می سازد. در تحقیق حاضر، 41.0% از نمونه ها با الگوی DFS IIF با استفاده از EUROLINE ANA Profile 3 plus DFS70 تایید شد که دارای اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 میباشند. بیزارو  و همکارانش حساسیت LIA را 51.6% (اختصاصایت 96.6%) با توجه به الگوی احتمالی DFS IIF روی سلول های HEp-2 گزارش دادند که مشابه سایر آزمونها بود (CLIA, 43.5%; dot blot, 51.6%). در سایر بررسی ها، میزان هماهنگی بین DFS IIF و آزمون های اختصاصی آنتی DFS70 (بعنوان مثال CLIA, ELISA, Westernblot) ،بین میزان 14% تا بیش از 90%، بسیار متفاوت بود. داده های ما با یافته های قبلی سازگار است، به این صورت که یک زیرمجموعه سرم با یک الگوی معمول DFS IIF، واکنش آنتی DFS70 را با استفاده از روش خاص تر نشان نمی دهد. برعکس، نمونه هایی با آنتی DFS70 مثبت بوسیله یک آزمون اختصاصی-تکی، ممکن است بطور واضح الگوی DFS IIF را نشان ندهند. عواملی که بطور بالقوه در این اختلافات سهم دارند: (1) هتروژن بودن مابین اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 که ایجاد یک الگوی معمول DFS روی سلول های HEp-2 می کنند اما همه آنها با ماده زمینه آنتی ژنیک بکاررفته در آزمون تکمیلی واکنش نشان نمی دهند. (2) واکنش آنتی ژن نوترکیب بمیزان کمی بوسیله روش آماده سازی آنتی ژن، پوشش دار شدن (از دست دادن اپی توپ کانفورماسیونی)، انتخاب میزات کات آف تحت تاثیر قرار می گیرد. (3) یک الگوی ANA مشابه DFS ممکن است توسط آنتی بادی های علیه آنتی ژن های هسته بجز DFS70 ایجاد گردد خصوصا پروتئین هایی که جایگاه سلولی مشابهی دارند همانند  MeCP2، PogZ ، c-Myc-interacting protein JPO2، یا  Cdc7-ASK. برای مثال مشخص گردید که MeCP2 همراه با DFS70 جایگاه مشترکی را در هسته دارا می باشند و الگوی مشابه DFS روی سلول های HEp-2 ایجاد مینماید که توسط پیش-جذب آنتی بادی های آنتی DFS70 تحت تاثیر قرار نمی گیرد.
طبق یک متاآنالیز اخیر، شیوع متوسط اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 ایزوله فقط حدود 0.7% در بیماران دچار SARD و و در آنتی DFS70 همراه با SARD-specific ENA فقط 3.8% می باشد. در مقایسه با این، آنتی DFS70 ایزوله مثبت با نسبت حدودی (LR+) 10.9 در غیاب SARD می باشد. با اشاره به الگوریتم تشخیصی توصیه شده بوسیله کنراد  و همکارانش، 74.2% بیماران ما با الگوی DFS IIF میتوانند بعنوان بعید بودن وجود یا پیشرفت SARD دسته بندی شوند، یا بوسیله وجود واکنش آنتی DFS70 ایزوله یا بوسیله عدم وجود ENA همراه با SARD یا DFS70 (عکس 2). گوندین  و همکارانش گزارش کردند که در هیچ یک از بیماران شان با نتایج مثبت برای آنتی DFS70 ایزوله، بیماری های SARD  در طول 10 سال پیگیری ایجاد نگردید. براساس بررسی جداول، ما همچنین هیچ شواهد بالینی مبنی برSARD فعال در موارد مثبت آنتی DFS70 ایزوله پیدا نکردیم. بلکه وجود خصوصیات سایر ENA ها  در سطوح بالا ارتباطات بالینی مختص با آن اتوآنتی بادی ها دارد. درحالیکه ارزیابی مرزی زیاد برای تشخیص مناسب نیستند، وجود ENA های تیتر بالای اضافی همبستگی نزدیک بالینی و پیگیری را تضمین می کند. این مشاهدات با طبقه بندی اتوآنتی بادی های آنتی DFS70 بعنوان یک بیومارکر پیش بینی منفی بالقوه برای SARD در غیاب سایر ENA های مرتبط از لحاظ بالینی، مطابقت دارد. اما، وجود آنتی بادی های آنتی DFS70 جایگزین تمایز ENA نمی باشد. اگر یک الگوی ANA با استفاده از روش IIF مشاهده گردید، بدون وابستگی به اینکه آیا آنتی بادی علیه DFS70 وجود دارد یا نه، تمایز دقیق ENA باید در هر مورد بدون استثنا انجام گردد. تنها زمانیکه هیچ ENA مرتبط با بیماری بعد از تشخیص تخصصی وجود نداشته باشد، یک نتیجه مثبت DFS70 می تواند به توضیح الگوی IIF مشاهده شده کمک نماید. اگر آزمایش تکمیلی بوسیله آزمون های چندپارامتری ("multiplexing") آنتی بادی مرتبط را نشان نداد، وجود سایر ENA ها را نمی توان نادیده گرفت و این موضوع خصوصا باید در بیماران مشکوک به SARD در نظر گرفته شود. همانطور که در تحقیق اخیری بحث گردید، تعداد پیگیری ها ممکن است در بیماران با نتیجه مثبت ANA IIF و منفی برای هر دوی ENA و آنتی DFS70، به یک یا دو بار در سال کاهش یابد. از طریق کاهش تعداد پیگیری های آزمایش آنتی بادی و ویزیت سرپایی در کلینیک، کمک زیادی به بهبود هزینه شده که مطابق با تجربه ماست.
بدلیل افزایش بار کاری، آزمایشگاهها غربالگری ANA خود را به روشهای اتوماتیک چندگانه بزرگ، با انتخاب استفاده از روش IIF بعنوان گام دوم، تغییر داده اند. بدلیل تعداد محدود آنتی ژن های خالص/نوترکیب، روش های چندگانه روی ANA هایی که از لحاظ بالینی اهمیت دارند متمرکز شده، اما نسبت به سلول های HEp-2 از حساسیت کمتری نیز برخوردار می‌باشند که منجر میشود حدود 35% بیماران دچار SARD نتایج غربالگری منفی نسبت به روش IIF داشته باشند. براین اساس، دانشکده آمریکایی روماتولوژی (ACR)  و کمیته بین المللی روش HEp-2 IIF را بعنوان روش غربالگری استاندارد برای تعیین ANA ، با هدف تقویت پتانسیل برجسته این تکنیک ، توصیه نمودند. در مواردیکه شواهد بالینی قوی مورد ظن است و روش های جایگزین منفی می باشند، انجام روش IIF اجباری است. این توصیه در مطالعات فعلی و قبلی که شامل آزمایش آنتی DSF70 است دنبال می گردد.
الگوریتم تشخیصی ارائه شده با چندین الگوریتم گزارش شده قبلی که شامل آنتی DFS70 میباشد مطابقت دارد به این صورت که در هر نمونه ای که الگوی DFS ANA در غربالگری HEp-2 IIF مشخص (مشکوک) باشد باید تست های تکمیلی برای آنتی بادی های مرتبط با آنتی DFS70 و SARD انجام گیرد (عکس 2). نتایج به پزشک متخصص گزارش داده می شود و کامنتی در مورد ارتباط تشخیصی نتیجه سرولوژیک، با اشاره به اهمیت یافته های بالینی و سایر آزمایش های آزمایشگاهی نیز داده شود.

بعنوان نتیجه، DFS70 ANA ها در بین جمعیت بیماران یک بیمارستان محلی شایع می باشد. تشخیص الگوی DFS  IIF با استفاده از ماده زمینه سلولهای غنی از میتوتیک HEp-2 و پیگیری با تست تکمیلی اختصاصی DFS70 باید جزو سرویس روتین آزمایش ANA باشد. استفاده از پانل گسترده ANA/ENA که شامل آزمایش اختصاصی DFS70 می باشد و ارتباط بالینی نزدیک، برای تایید "خاص" آنتی DFS70 بعنوان علت تیتر افزایش یافته ANA لازم می باشد. افزایش قابل توجه سایر ENA ها علاوه بر آنتی DFS70 ممکن است منعکس کننده بیماری SARD باشد، و ارتباط بالینی مرتبط و انجام آزمایش های پیگیری کننده را ضمانت نماید. این آزمایشات باعث اطمینان بیماران DFS70 ANA مثبت می شود که ممکن است در غیر این صورت برای آزمایش های گسترده ای برای بیماری های خودایمنی مراجعه کنند. یک DFS70 ANA ایزوله وجود SARD را حذف نمی کند زیرا که عمدتا یک تشخیص بالینی است که توسط شواهد آزمایشگاهی پشتیبانی می شود. این به سادگی یک نقطه تشخیصی نیست که از تشخیص SARD حمایت نماید. از آنجاییکه بسیاری از پزشکان هنوز با DFS70 ANA آشنا نیستند، همه یافته های مرتبط باید به وضوح در گزارش های آزمایشگاهی توضیح داده شود.

منبع:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5900435/