جمع آوری نمونه خون بر روی کاغذ مخصوص نمونه برداری ( DBS)

روش توصیه شده برای نمونه برداری در غربالگری بیماری های متابولیک ارثی نوزادان، روش خون گیری از پاشنه پای نوزاد و انتقال مستقیم بر روی کارت نمونه برداری (Heel Stick with direct application onto (paper filter می باشد.
زمان مناسب جهت نمونه برداری: بهترین زمان جهت نمونه برداری در غربالگری بیماری های متابولیک ارثی نوزادان بین 48 تا 92 ساعت پس از تولد نوزاد( 2 تا 3 روزگی) می باشد زیرا در این زمان با توجه به تغذیه کافی نوزاد با شیر مادر، تعادل لازم بین برقراری مسیرهای متابولیکی در بدن نوزاد و افرایش متابولیک های قابل اندازه گیری، با اجتناب از تاخیر در تشخیص بیماری و بروز علایم برقرار می باشد. البته مناسبت ترین زمان که اجماع نظر کارشناسان روی آن وجود دارد 72 ساعت پس از تولد ( 3 روزگی) می باشد.
 در مورد نوزادان طبیعی زمان نمونه گیری می تواند حداقل 36 ساعت پس از تولد و حداکثر 120 ساعت پس از تولد (5روزگی) نوزاد باشد.
 از نوزادان نارس( با وزن کمتر از 1500 گرم) باید یک نمونه در روزهای سوم تا پنجم و یک نمونه در یک ماهگی (با وزن بیشتر از 2 کیلوگرم) گرفته شود.
 از نوزادان بیمار(بستری در بیمارستان به هرعلتی) باید یک نمونه در روزهای سوم تا پنجم و یک نمونه در زمان ترخیص از بیمارستان(در شرایط بهبود) گرفته شود.

 نگهداری کاغذهای مخصوص نمونه گیری قبل از استفاده جهت غربالگری: بهتر است بسته های کاغذ مخصوص نمونه گیری از پهلو در کنار یکدیگر قرار گیرند و از روی هم قرار دادن بسته های کاغذ اجتناب شود مخصوصا زمانی که تعداد زیادی از این کارت ها ذخیره می شوند، زیرا وزن این کارت ها بر روی همدیگر باعث تراکم در بافت فیبری کارت شده و باعث کاهش در ظرفیت پذیرش خون در کارت می شود.

 

وسایل مورد نیاز جهت نمونه برداری از پاشنه پای نوزاد:

•  لانست یک بار مصرف

• پد الکلی یا پنبه الکلی ( ایزوپروپیل الکل 70 % یا اتیل الکل 70

• گاز استریل

• کارت مخصوص نمونه برداری

• دستکش بدون پودر

• کیسه آبگرم یا حوله گرم مرطوب

• رک مخصوص خشک کردن کارت نمونه برداری

• بالشتک رطوبت گیر

• کارت نشانگر رطوبت

• کیسه پلاستیکی درب زیپ دار

 

 اقدامات قبل از نمونه برداری:

پس از انجام مرحله پذیرش، نوزاد جهت نمونه گیری خون مویرگی به بخش نمونه گیری هدایت شده و مراحل ذیل طی گردد.
 انطباق مشخصات برگه درخواست آزمایش با مشخصات نوزاد: در این مرحله فرد نمونه گیر موظف است اطلاعات ثبت شده در برگه درخواست آزمایش نظیر نام، نام خانوادگی نوزاد را از همراه نوزاد پرسیده و با مشخصیات ثبت شده فرد در کارت شناسایی معتبر مطابقت دهد. در صورت عدم تطابق مشخصات در این مرحله نمونه گیر موظف است نوزاد را جهت کنترل و اعلام نظیر به بخش پذیرش راهنمایی نماید.

 کامل نمودن اطلاعات درخواستی بر روی کارت و فرم مخصوص غربالگری: فرد نمونه گیر موظف است با توجه به متفاوت بودن میزان اطلاعات درخواستی بر روی کارت های مختلف، حداقل فیلد های مربوطه بر روی کارت ها را با توجه به موارد زیر به صورت کامل و خوانا تکمیل نماید این موارد شامل:

•  نام و نام خانوادگی نوزاد

•  جنسیت

•  تاریخ و ساعت تولد

•  تاریخ و ساعت نمونه برداری

•  نام و نام خانوادگی مادر نوزاد

•  نام بیمارستان محل تولد

انتخاب محل مناسب برای نمونه برداری از پاشنه پا: فرد نمونه گیر موظف می باشد برای نمونه گیری از قسمت های کناری کف پا استفاده نماید.
توجه: در نوزادان از نواحی مانند نرمه گوش، ناحیه مرکزی پاشنه پا، انگشتان دست و پا و نواحی متورم یا نواحی که قبلا سوراخ شده اند نباید خونگیری صورت گیرد. فرد نمونه گیر موظف می باشد برای نمونه گیری از قسمت های کناری کف پا استفاده نماید.

 

مراحل تهیه نمونه خون مویرگی از پاشنه پا

نکات مهم قابل توجه قبل از شروع نمونه گیری
نکته مهم 1 : فرد نمونه گیر به یاد داشته باشد که در هنگام آزمایش، توسط یک پانچ، حلقه ای با قطر مشخص از فیلتر جدا شده و در بافر مناسب حل می گردد. اگر نمونه به طریقه مناسب روی کارت نمونه گیری گذاشته شده باشد، قطر حلقه جدا شده متناسب با حجم معینی از خون خواهد بود. در صورتی که نمونه گیری به درستی انجام نشود، میزان نمونه برداشت شده معادل مقدار مورد نیاز نبوده و در نتیجه در محاسبات اختلال ایجاد خواهد شد، بنابراین هنگام نمونه برداری از موارد زیر اجتناب کنید:

• استفاده از یک قطره خون پاشنه پا برای بیشتر از یک دایره روی کارت،

•  استفاده از چند قطره خون برای یک دایره،

•  استفاده از قطرات بزرگ خون که باعث تداخل دایره های روی کارت با یکدیگر شود.

نکته مهم 2 : مدیریت استرس نوزاد در هنگام نمونه برداری:
اقدامات زیر  حین نمونه برداری می تواند باعث کم شدن استرس در نوزادان و راحتی نمونه برداری شود:

•  ماساژ آرام پاشنه پا قبل از نمونه برداری

•  مکیدن پستانک در حین نمونه برداری توسط نوزاد

•  شیر دادن حین نمونه برداری

• قنداق کردن نوزاد در حین نمونه برداری

توجه 1 : از کرم های موضعی ضد درد استفاده نشود زیرا موجب بی اعتمادی به جواب های حاصله خواهد شد
توجه 2 : تب ناشی از واکسیناسیون مانع از انجام نمونه گیری نمی باشد.
توجه 3 : جهت نمونه گیری برای غربالگری، ناشتا بودن نوزاد لازم نمی باشد. اما برای آزمایش فنیل آلانین رعایت 3 تا  4 ساعت ناشتایی ضروری می باشد.

مراحل عملی نمونه گیری:

• بهتر است نمونه گیری در یک اتاق مجزا و کم رفت و آمد واجد دستشویی برای شست و شوی دست ها در فواصل نمونه گیری باشد. در صورت عدم دسترسی به آب، باید محلول های ضدعفونی کننده دست موجود باشد. لذا دست ها را به خوبی شسته/ ضدعفونی کرده و پس از خشک کردن دستکش یک بار مصرف بدون پودر بپوشید.

• قبل از نمونه گیری، پاشنه پای نوزاد به مدت 3 دقیقه کمی گرم شود. (با استفاده از حوله گرم مرطوب با دمای کمتر از 42 درجه سانتی گراد)

• قسمت مورد نظر را با پد یا پنبه الکلی( ایزوپروپیل الکل 70 % یا اتیل الکل 70 % ) به صورت دایره وار و از مرکز به سمت خارج به دقت ضد عفونی نموده و اجازه دهید محل انتخاب شده جهت نمونه گیری در مجاورت هوا خشک شود.

ناحیه مورد نظر را با لانست استریل سوراخ نمایید ( عمق سوراخ ایجاد شده حدود 2 میلی متر باشد). اولین قطره خون را با گاز استریل پاک کنید زیرا حاوی مایع میان بافتی و نمونه رقیق شده می باشد. سپس اجازه دهید یک قطره بزرگ از خون تشکیل شود. جهت تسریع در تولید قطره می توانید اندکی پاشنه پای نوزاد را بفشارید.

 در صورتی که نمونه گیری از محل لانست زده انجام نشد از زدن لانست مجدد در همان محل خودداری و محل مناسب دیگری را جهت نمونه گیری انتخاب نمایید.

 به آهستگی اولین دایره روی کاغذ را با قطره بزرگ خون تماس دهید. توجه نمایید عمل تماس با سطح کاغذ برای هر دایره تنها یک بار صورت گیرد. کاغذ صافی را به پاشنه پا تماس ندهید.غلظت مناسب خون را می توانید از آغشتگی پشت کاغذ صافی تخمین بزنید. قطر لکه خون قابل مشاهده به صورت یکنواخت از دو روی کاغذ نباید از 5 میلی متر کمتر باشد.

 دایره های باقی مانده را به طریق مشابه پر کنید. به یاد داشته باشید که هر دایره باید فقط با یک قطره خون پر شود.

از تماس دست با دایره های روی کارت پرهیز نموده و مراقب باشید که با سطوح مختلف تماس نداشته باشد.

 

توجه: کارت های واجد هر گونه خراشیدگی در سطح منطقه نمونه گذاری را از گردش کار خارج کرده به هیچ عنوان استفاده نکنید.

 پای نوزاد را بالاتر از بدنش نگه دارید و با یک گاز استریل موضع را تا بند آمدن خون بفشارید. سپس محل نمونه گیری را با چسب زخم مناسب پانسمان نمایید.

 

 مراحل پس از نمونه برداری:

 کاغذهای مخصوص نمونه گیری لکه گذاری شده با خون نوزاد/بیمار را بر روی رک مخصوص خشک کردن کارت در دمای محیط 30-25 درجه سانتیگراد در یک فضای خشک و تمیز، دور از نور مستقیم خورشید و همواره به صورت افقی به مدت 3 الی 4 ساعت خشک کنید. از لوازمی نظیر سشوار، انکوباتور و یا دیگر وسایل گرم کننده استفاده نکنید. در مناطقی که درصد رطوبت هوا بالا می باشد ممکن است زمان خشک شدن بیشتر طول بکشد.

 

نمونه گیری جهت بررسی ارگانیک اسیدوری:

 نمونه مناسب برای بررسی ارگانیک اسیدوری ترجیحا قسمت میانی ادرار صبحگاهی به میزان حداقل 7 میلی لیتر، جمع آوری شده در ظروف استریل مخصوص جمع آوری ادرار می باشد. لذا مسئول نمونه گیری موظف است راهنمایی های لازم را به همراه بیمار بنماید تا یک نمونه مناسب با حجم کافی از بیمار گرفته شده و به آزمایشگاه تحویل شود.

 در صورت امکان و ترجیحا، نمونه گیری در زمان حمله بیماری و قبل از شروع روند درمان انجام گیرد.

 

نکات مهم قابل توجه قبل از نمونه گیری

1 ) رژیم غذایی: بیمار بهتر است از خوردن سیب، انگور، گلابی و زغال اخته و همچنین آب میوه آنها در 24 ساعت منتهی به نمونه برداری اجتناب کند.

2 ) رژیم دارویی: در صورتی که بیمار مولتی ویتامین یا مولتی مینرال مصرف میکند با هماهنگی با پزشک معالج به مدت 24 ساعت مصرف آنها قطع شود.

 

 نگهداری نمونه قبل از آزمایش:

در صورتی که انجام آزمایش تا 24 ساعت پس از نمونه برداری امکان پذیر باشد، نمونه ها به مدت 24 ساعت در یخچال ˚C  8 - 2  قابل نگهداری می باشند. در غیر این صورت نمونه ها بلافاصله پس از نمونه برداری در فریزر20-   درجه سانتیگراد  قرار داده شده و تا زمان آزمایش در شرایط فریز نگهداری شود.  جهت انتقال نمونه به آزمایشگاه دیگر نمونه فریز شده را کنار یخ خشک قرار داده تا در حالت فریز منتقل شود.

 

 

نمونه گیری جهت آزمایش آمونیاک خون:

 نمونه گیری:

قبل از اقدام به نمونه گیری اطمینان حاصل نمایید شرح حال دقیق بیمار و داروهای مصرفی توسط وی، در قسمت پذیرش توسط مسئول پذیرش در پرسشنامه بیمار ثبت شده باشد.

 نمونه خون از ورید (یا شریان زیر نظر پزشک) دارای جریان آزاد، درلوله های نمونه گیری(ترجیحا از پیش سرد شده) حاوی هپارین سدیم یا هپارین لیتیم ( 12-30 IU Heparin/ml Blood (و عاری از آلودگی آمونیاکی (مانند محلول های حاوی اوره آز، دود سیگار و سایر محلول های آزمایشگاهی و ...) جمع آوری شود و درب آن کاملاً محکم بسته شود. اگر از لوله های ونوجکت هپارینه استفاده می شود لوله بایستی به طور کامل پر شود .

 بیمار باید در شرایط بدون استرس نمونه گیری شود، سوراخ کردن محکم رگ با ضربه شدید می تواند باعث افزایش کاذب سطح آمونیاک می شود.

حتی الامکان نباید از تورنیکه استفاده شود و در صورت استفاده از آن برای پیدا کردن محل رگ، باید قبل از نمونه گیری، 1 دقیقه آن را باز کرد تا جریان خون طبیعی شود.

 نمونه گیری باید قبل از هرگونه اقدام درمانی یا توقف تغذیه ای انجام شود زیرا شرایط بدون تغذیه می تواند باعث به دست آمدن نتایج نرمال کاذب شود.

 از اختلاط نمونه با هوا جلوگیری شود.

 به غیر از شرایط اورژانس، نمونه گیری باید درحالت ناشتا (یا حداقل 6 - 4 ساعت پس از صرف غذا)،بدون فعالیت بدنی قبلی و عدم مصرف سیگار حداقل به مدت 9 ساعت قبل از نمونه گیری، جمع آوری شود.

 بلافاصله پس از جمع آوری و تا زمان جدا نمودن پلاسما باید آن را در یخچال یا در مجاورت یخ نگاه دارید .

پس از نمونه گیری، سریعاً پلاسما را جدا نمایید. جهت جداسازی پلاسما از سانتریفیوژ یخچالدار استفاده نمایید .

 نمونه را روی یخ گذاشته و در یخچال 8-2 درجه سانتیگراد نگهداری نمایید و ظرف مدت 20 دقیقه پس از خونگیری اقدام به انجام آزمایش کنید.

 

 نحوه جابه جایی و میزان پایداری نمونه در صورت ذخیره قبل از انجام آزمایش:

• در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه نمونه باید در مجاورت یخ و در طی2 دقیقه به آزمایشگاه ارسال شود.

• آمونیاک پلاسما در درجه حرارت70  -درجه سانتیگراد به مدت چندین روز پایدار باقی می ماند. در صورت انجماد نمونه در 20 -درجه سانتیگراد  غلظت آمونیاک حداقل به مدت 24 ساعت ثابت می ماند .

• غلظت آمونیاک در درجه حرارت یخچال( 8-2درجه سانتیگراد) بمدت 2 ساعت ثابت می ماند.

• نمونه پلاسمای همولیزه، سرم و نمونه ای که بیش از 20 دقیقه از گرفتن آن گذشته باشد برای آزمایش مناسب نمی باشد

 

نمونه گیری جهت آزمایش لاکتات، پیروات و کتون بادی ها در خون:

 نمونه گیری:

• جهت اندازه گیری همزمان چهار متابولیت (لاکتات، پیروات، ACAC و 3OHB) باید از نمونه خون وریدی دپروتئینه شده بوسیله پرکلریک اسید استفاده شود.

• نمونه مناسب برای آزمایش لاکتات ترجیحا سرخرگی(زیر نظر پزشک) بدون استفاده از تورنیکه بوده که بعد از دو ساعت ناشتایی در لوله های هپارینه (IU Heparin/ml Blood12-30 )جمع آوری شود. برای آزمایش 5 .0 میلی لیتر پلاسمای هپارینه عاری از همولیز)حداقل 2 .0 میلی لیتر( لازم می باشد.

• نمونه خون برای آزمایش پیروات بعد از رعایت 4 ساعت ناشتایی بدون استفاده از تورنیکه، حتما در ظرف حاوی پرکلریک اسید جمع آوری شود .(یک سی سی خون در لوله حاوی 2 میلی لیتر پرکلریک اسید 6 .0 مولار)

• پیروات و ACAC پارامترهای بسیار ناپایداری هستند، بنابراین بلافاصله بعد از نمونه گیری، باید عمل دپروتئینه کردن انجام شود.

• بیمار قبل و حین نمونه گیری نباید دستش را مشت نماید.

• هنگام نمونه گیری از تورنیکه استفاده نکنید.

توجه: بستن تورنیکه، جمع آوری سخت نمونه و گریه و تقلای فرد هنگام نمونه گیری منجر به افزایش کاذب لاکتات می شود.

• از خون گیری مویرگی اجتناب نمائید.

 

جابه جایی و ذخیره نمونه:

• لوله ها باید روی یخ آب جابه جا شوند.

• پلاسما در عرض 15 دقیقه پس از نمونه گیری با استفاده از سانتریفوژ یخچال دار جدا شود.

• سطح لاکتات در پلاسما، با رعایت شرایط ذکر شده در بالا ، به مدت 1 هفته در درجه حرارت یخچال(8 - 2 درجه سانتیگراد) و به مدت یک ماه در 20-درجه سانتیگراد  پایدار است.

• پایداری متابولیت های 4 گانه، درون محلول به دست آمده فوق در دمای 20-درجه سانتیگراد  ،5 روز است.

 

 نمونه گیری جهت آزمایش اندازه گیری اسیدهای آمینه خون:

نمونه گیری:

• ترجیحا برای آزمایش اسیدهای آمینه خون باید از پلاسمای هپارینه (سدیم یا لیتیم) استفاده شود . جهت گرفتن خون وریدی از بیمار اقدام نموده 2 تا 3 میلی لیتر خون از بیمار بگیرید.

• بیمار باید حداقل به مدت 4 ساعت ناشتا باشد.

• در هنگام نمونه گیری و جداسازی پلاسما با سانتریفوژ از ایجاد همولیز در نمونه اجتناب شود.

• جهت جدا سازی از سانتریفوژ یخچال دار استفاده شود. پس از جداسازی، پلاسما را در حجم های مناسب در لوله های پلاستیکی تقسیم نمایید. میزان پلاسمای مورد نیاز برای هر آزمایش 5 / 0 میلی لیتر عار ی از همولیز است. ( حداقل میزان پلاسمای مورد نیاز 3 / 0 میلی لیتر می باشد).

• پس از جداسازی پلاسما، نمونه ها باید سریعا دپروتئینه شوند در صورتی که امکان آزمایش سریع وجود ندارد نمونه ها را در فریزر20-درجه سانتیگراد قرار دهید.

 جابه جایی نمونه: نمونه ها باید به صورت فریز شده و کنار یخ خشک و در بسته بندی سه لایه مخصوص نمونه های بیولوژیک انتقال داده شوند.

 

 نکات ایمنی:

• پرسنل نمونه گیر باید همیشه از روپوش (با دکمه های بسته) و دستکش بدون پودر به هنگام نمونه گیری و جابجایی نمونه بیماران استفاده نماید. دستکش می بایست در صورت آلودگی و یا در فواصل نمونه گیری ها تعویض شده و نباید شسته و مجدداٌ مورد استفاده قرار گیرد.

• دست ها باید در فواصل نمونه گیری به تناوب شسته شوند.

• پسماند های تیز، برنده و آلوده مانند لانست ها باید در ظرف ایمن( Safety Box ) جمع آوری شده و زمانی که 4 / 3 ظرف پر شد، پس از آلودگی زدایی با اتوکلاو، به طریقه بهداشتی دفع گردد.

• در صورت آلودگی هر قسمت از اتاق نمونه گیری باید سریعا با مواد ضدعفونی کننده مانند هیپوکلریت سدیم با رقت 5 گرم در لیتر (5 . 0 گرم درصد) و یا هرگونه محلول سفیدکننده خانگی(مشروط بر داشتن کلر فعال 5 درصد) بوی کلر از آن متصاعد شودکه به نسبت 10 .1 رقیق شده باشد (محلول 10 درصد) ضدعفونی نمود. لازم به ذکر است که محلول فوق باید برای هر بار به صورت تازه تهیه گردد.

 در صورت بروز حوادث مخاطره انگیز نظیر فرو رفتن لانست در دست، اقدامات زیر باید صورت گیرد:

1) خارج نمودن دستکش،

2). فشار بر روی موضع جهت خروج خون،

3) شستن موضع با آب و صابون،

4) گزارش حادثه به مسئول ایمنی،

5) انجام اقدامات بعد از حادثه طبق دستورالعمل های ایمنی آزمایشگاه.

 

 

نتیجه گیری و نکات مهم :

غربالگری بیماری های متابولیک ارثی برای همه نوزادان باید انجام شود.

 

زمان انجام آزمایش غربالگری نوزادان :

باید بعد از 48 ساعت و حداکثر یک هفته پس از تولد انجام شوند (به نحوی که حداقل 36 ساعت از خوردن شیرِ نوزاد، گذشته باشد). آزمایش‌هایی که در طرح‌های غربالگری مورد استفاده قرار می‌گیرند باید پیش از مرخص شدن نوزاد از بیمارستان و یا طی 5 روز اول پس از تولد انجام شوند. انجام تست غربالگری در روز اول تولد، قابل اطمینان نبوده و باید مجدداً تکرار شود.

 

شرایط انجام آزمایش غربالگری نوزادان :

 جمع آوری نمونه از نوزادی که با شیر مادر تغذیه نمی شود ممکن است منجر به نتایج منفی کاذب در آزمایش غربالگری شود. این امر بخصوص در مورد فنیل کتونوری و گالاکتوزمی اهمیت دارد. در این نوزادان نمونه گیری مجدد پس از تغذیه با شیر مادر ضروری است. تغذیه نوزاد از طریق سرم ، نتایج آزمایشهای غربالگری را تحت تاثیر قرار می دهد. قبل از انجام آزمایش نوزاد، باید به مدت 2 تا 3 ساعت شیر نخورده باشد، رعایت این زمان در کسب نتیجه درست اهمیت دارد.

 

نوع نمونه برای انجام آزمایش غربالگری نوزادان :

پس از گرم کردن پای نوزاد و تمیز کردن ناحیه مورد نظر با ماده ضد عفونی کننده مخصوص، با استفاده از یکسوزن خاص (لانست) که به پاشنه پای نوزاد زده می‌شود، چند قطره خون بر روی کاغذ صافی مخصوص جمع‌آوری شده و پس از 3 تا 4 ساعت در حرارت اتاق خشک می‌شود.

 از نوزادان نارس (با وزن کمتر از 1500 گرم) یا بیمار باید یک نمونه در روزهای سوم تا پنجم و یک نمونه نیز در یک ماهگی (وزن بیشتر از 2 کیلوگرم) و یا زمان ترخیص از بیمارستان گرفته شود. اگر در یک نوزاد نارس، نتیجه آزمایش غربالگری نتایج غیر طبیعی و نوزاد دارای علائم بالینی خاصی باشد، برای تائید بیماری باید بلافاصله آزمایش تکرار گردد.همچنین در نوزادان نارس افزایش فیزیولوژیک 17 – هیدروکسی پروژسترون و کاهش تیروکسین ممکن است مشاهده شود.

 

چرا گاهی یک نمونه خون دیگر لازم است؟

نوزادانی که با غربالگری به عنوان کودکان دارای افزایش خطر ابتلا به بیماران متابولیک شناسایی می شوند، نیاز است تا نتیجه آزمایش آن­ها آن با استفاده از تست های تشخیصی تأیید گردد. از آنجایی که نتیجه مثبت کاذب استرس زیادی برای خانواده ها ایجاد می کند، تشخیص دقیق بیماری از اهمیت ویژه ای برخوردار است. اگر نیاز باشد که یک نمونه خون دیگر از نوزاد گرفته شود، آزمایشگاه به شما اطلاع خواهد داد. همچنین مهم است که نمونه جدید از نوزاد شما تا حد ممکن سریعتر گرفته شود تا غربالگری نوزاد تکمیل گردد.